이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식
Summary
새로운 두뇌 지구에서 젊은 신경 도전 어떻게 환경 sculpts 신경 운명과 성숙에 중요 한 통찰력을 밝힐 수 있다. 이 프로토콜 interneuron 선구자 특정 두뇌 지역에서 수확 하 고 그들에 게 어느 homotopically를 이식 하는 절차에 설명 합니다 또는 출생 후 새끼의 뇌에 heterotopically.
Abstract
신경 운명 결정과 성숙 유전 프로그램 및 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 요구 한다. 그러나,이 분화 과정을 조절 하는 외부 메커니즘 대 내장의 역할 disentangling 모든 발달 neurobiologists에 대 한 수수께끼 이다. 이 문제는 GABAergic 수, 과도 미 발달 구조에서 태어나 고는 telencephalon 걸쳐 분산 수와 철새 단계를 받아야 하는 매우 다른 유형의 세포 인구에 대 한 확대 됩니다. 어떻게 다른 두뇌 환경 영향 interneuron 운명과 성숙 탐험, 우리 붙일 레이블된 미숙한 interneuron 선구자 신생아 쥐 (P0-P2)에 있는 특정 한 두뇌 지역에서 수확에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 이 나이에, interneuron 마이그레이션이 거의 완료 되 고이 세포는 상대적으로 작은 시 냅 스 통합 된 그들의 마지막 휴식 환경에 거주 하는. Cytometry 통해 단일 셀 솔루션의 컬렉션, 다음 이러한 interneuron 선구자 P0-P2 wildtype 출생 후 새끼로 이식 됩니다. 두 homotopic 수행 하 여 (예를 들어, 피 질-피 질) 또는 heterotopic (예, 피 질-해 마) 이식, 수 평가 새 뇌 환경에 미 숙 수 도전 미치는 그들의 운명, 성숙, 그리고 회로 통합. 두뇌는 성인 쥐에 수확 될 수 있으며 immunohistochemical를 포함 하 여 이식할된 셀에 posthoc 분석의 광범위 한 분석 electrophysiological 및 transcriptional 프로 파일링. 이 일반적인 접근 방식을 제공 합니다 어떻게 가지 두뇌 환경 분석 결과를 전략 수 있습니다 신경 개발의 많은 측면에 영향을 미칠 수 사와 특정 신경 특성은 주로 내장 돼 유전자 프로그램에 의해 구동 확인 또는 환경 단서입니다.
Introduction
적절 한 대뇌 피 질의 기능 필요 흥분 성의 프로젝션 뉴런을 억제 GABAergic 수, 명료한 형태학, electrophysiological 속성, 연결 된 매우 이질적인 인구 사이 균형 및 neurochemical 마커입니다. 비정상적인 개발 및 기능 수 (및 특정 interneuron 하위 그룹)의 정신 분열 증, 자폐증, 간 질1,2,3등 정신 장애의 pathobiology에 연결 되었습니다. 또한, 이러한 뇌 장애에 연루 된 많은 유전자는 젊은 수4농축 강력 하 게. 따라서, interneuron 운명 결정 및 성숙 조절 메커니즘의 이해는 정상적인 개발 및 수많은 뇌 질환의 잠재적인 etiologies 이해 필요 합니다.
개 수는 주로 두 가지 과도 배아 구조, 중간 그리고 꼬리 절 정령에서 태어난 (MGE 및 CGE, 각각). 이러한 postmitotic 세포 (interneuron 선구자)는 telencephalon 걸쳐 분산 그들은 다양 한 회로 통합할 수와 접선 마이그레이션 단계를 받 다. MGE 파생 수 세 크게 겹치지, neurochemically 정의 된 하위 그룹의 구성: 빠른 parvalbumin (PV+) 수, 비-빠른 somatostatin (SST+) 수 급상승 급상승 하 고 늦게 신경 급상승 질소 산화물 synthase (nNOS+) 수 hippocampal 아이비와 neurogliaform 세포를 구성 하는. 수많은 연구소 PV+ 또는 SST + 수, morphogens, interneuron 일어나, 생년월일 및 neurogenic 사단의 모드의 공간 그라디언트를 포함 하 여 초기 운명 결정을 통제는 MGE 내의 여러 메커니즘을 확인 했습니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 수 처음 ‘추기경 클래스’로 차별화 하 고 다음 점차적으로 성숙 ‘최종 클래스’ 그들은 그들의 환경11상호 작용으로 제안 되었습니다. 최근의 증거는 나타냅니다 일부 성숙한 interneuron 하위 유전자 내장 돼 이러한 세포가 절 정령에 postmitotic로 나타내는 초기 정의 본질적인 유전 프로그램 이전 보다 더 큰 역할을 할 수 있습니다. 평가12,13. 그러나, 본질적인 유전 프로그램 별개 interneuron 하위 유형으로 차별화 실현 환경 신호 상호 작용 하는 방법의 핵심 문제 크게 미개척 남아 있습니다.
수많은 연구는 다양 한 뇌 영역, 성숙 세포를 융합 하 고 일반적으로 지역 내 생 회로14,15, 억제 하는 GABA를 해제 합의 결과에 직접 배아 MGE 셀을 이식 16,17,,1819. 이러한 관측을 약속 인간 유도 만능 줄기 세포 (hIPSC)를 사용 하 여에 상당한 관심을 생성-다양 한 뇌 질환을 치료 하는 수를 파생. 그러나, 하나의 중요 한 구성 요소 변환 방법 들에 대해 생각 한다 이러한 연구의 거의 평가이 이식할된 세포 성숙 수의 예상된 유형으로 성숙 하는 경우.
해결 하기 위해 어떻게 환경 영향 interneuron 분화 및 성숙, 전략 이식할된 수는 호스트의 기능 채택 여부를 시험 하기 위하여 새로운 뇌 환경에 미 숙 interneuron 선구자를 이식 하 고안 되었다 환경 또는 기증자 환경20에서 기능을 유지. MGE 이식은 MGE interneuron 및 수많은 두뇌 지역21에 걸쳐 분산 GABAergic 프로젝션 셀의 혼합된 인구를 포함 하기 때문에이 문제를 해결 하기 위해 적합 하지 않습니다. 이러한 MGE 셀 마이그레이션한 것 모르고 하나 평가할 수 있습니다 없습니다 완전히 어떻게 이러한 이식 두뇌 환경에 의해 영향을 받습니다. 이른 출생 후 timepoints에서 interneuron 선구자, 수확 하 여이 문제는 미 숙 셀의 마이그레이션을 완료 하 고 그들의 목표에 도달 하 여 피할 지역 뇌 하지만 최소한의 상호 작용 환경. 다른 두뇌 지구 사이 표현 차동 수의 특정 기능에 집중 함으로써, 하나는 다음 호스트 환경 interneuron 속성을 변경 하는 방법을 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 일반적인 접근 모든 조사에 적용 해야 새로운 환경에 도전 젊은 신경 세포를 검사 하 고 싶어 때 행동.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 하나의 중요 한 측면은 세포의 생존을 극대화 이다. 조직과 세포는 항상 얼음 감기 carboxygenated sACSF에서 보장 하는 것은 세포 생존을 촉진 하는 데 필요한입니다. 이 효율적인 해 부와 셀 다양 한 솔루션 및 두뇌 환경 외부 지출 시간의 길이 최소화 하기 위해 분리 전략을 필요 합니다. 뇌 영역 해 부 되 고 이식의 수에 따라 실험의 길이 감소 해 부 또는 이식 단계에서 원조 하는 파트?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 건강의 국가 학회 (K99MH104595)와 T.J.P. NICHD 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 우리는 그 실험실에서이 방법은 원래 설립 Gord Fishell 감사 합니다.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
Referências
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
