Summary
여기, 우리가 근접 결 찰 분석 결과 (PLA)를 사용 하 여 높은 감도와 고정된 셀에 MST1/MST2 heterodimerization를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.
Abstract
레 귤 레이트 된 단백질-단백질 상호 작용은 많은 신호 이벤트, 지도 원리 이며 이러한 이벤트의 검출 같은 경로 구성 하는 방법을 그들이 작동 하는 방식 이해는 중요 한 요소. 셀, 단백질 단백질 상호 작용을 검출 하는 많은 방법이 있다 그러나 상대적으로 몇 가지를 사용할 수 있는 내 생 단백질 사이 상호 작용을 검출. 그러한 한 방법, 근접 결 찰 분석 결과 (PLA), 그것의 사용을 추천 하 몇 가지 장점이 있습니다. 단백질 단백질 상호 작용 분석의 다른 일반적인 방법에 비해, PLA는 상대적으로 높은 감도 특이성, 최소 셀 조작, 그리고, 여기에 설명 된 프로토콜에서 수행할 수 있습니다, 그리고 특정 대상만 두 필요 다른 종에서 파생 된 항 체 (예., 마우스와 토끼에서)와 1 개의 특수 시 약: covalently 특정 연결 된 oligonucleotides는 이차 항 체의 집합, 서로 가까이에 때, 만들는 제자리에서 PCR 또는 압 연 원형 증폭에 대 한 amplifiable 플랫폼. 이 프레 젠 테이이 션에서 우리 고정된 셀에 MST1 및 MST2에에서 변화를 시각화 하기 위해 PLA 기법을 적용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 원고에 설명 된 기술은 세포 신호 전달 연구의 분석에 특히 적용 됩니다.
Introduction
MST1/Hippo 신호 장애 발달 장애 및 발암1에 연결 되었습니다. 포유류에서 MST1 및 MST2 kinases 활성화 (phosphorylate) MOB1 및 LATS1/2, 후자는 phosphorylates 그리고 transcriptional 공동 활성 제 예 관련 단백질 (YAP)2생긴다. 활성 (unphosphorylated) 형태로 얍에 종양 활동, 세포 증식 유전자;의 녹음을 향상 반대로, 야프 뚱 땡 통로 의해 비활성화 됩니다, 세포 증식을 억제 하 고 apoptosis 승진3. 조직, MST1 및 MST2 활성 homodimers, 주로 존재 하지만 종양 자극 MST1/MST2 heterodimers의 수준을 높일 수 있으며 같은 heterodimers 비활성4. 그러나, MST1/MST2 heterodimerization 규제 어떻게 제대로 이해 남아 있다. 호모-및 heterodimers MST1의 C-터미널 코일 코일 지역 및 MST2 사라 도메인5로 알려진 사이의 상호 작용 중재 를 통해 있습니다. 사용 하는 제자리에서 PLA 시연이 문서에서 우리는 인간의 Schwann 세포 (HSC)와 인간 미 발달 신장 세포 (HEK 293)에 MST1/MST2 heterodimers의 존재를 표시. PLA 생 단백질-단백질 상호 작용, 식별 하 고 transgene 식의 필요 또는 피토 프 태그의 사용 없이 측정할 수 있는 감지를 허용 하기 때문에 다른 단백질/단백질 상호 작용 검출 방법에 비해 이점이 있다 6.
신호 변환 통로 크게 구성 단백질의 조건부 협회에 의해 제어 됩니다. 예를 들어 대부분 수용 체 티로신 kinases의 자극 양식 추가 단지 그들의 호모 이합체 또는 이종 화 및 후속 연관 추가 세포내 신호 전달 단백질를 스스로 리드. PLA 방법의 목적은 셀, 단백질 사이 근접 시각화 하 단백질 보다 30-40 nm 간격에 제공. 단백질 근접 일반적으로 첫 번째 종에 발생 하는 적절 한 기본 항 체와 세포 잠복기에 의해 검출 된다 (예., 토끼와 마우스) 각 상호 작용 단백질에 대 한 추가 종의 2 차 항 체, 전 짧은 결합 된 DNA 프로브합니다. DNA 프로브 가까운 위치에, 모두 제자리에서 PCR에 의해 또는 원 메커니즘을 압 연 하 여 확대를 위한 플랫폼을 형성 하는 이러한 프로브는 특정 연결 DNA oligonucleotide 동시에 바인딩할 수 있습니다. 증폭 반응에 추가 하는 형광 태그 허용 쉽게 계량 하 고 셀7,8, 에서 특정 영역에 지역화 된 수 있는 형광 점으로 표시 되는 상호 작용 단백질의 시각화 9 , 10.
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Protocol
1입니다. 솔루션의 준비
- 통 솔루션 준비: 1 x PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA). 10 ml, 16%의 2.5 mL 걸릴 PFA 1 x PBS의 7.5 mL를 추가.
위험: PFA는 낮은 복용량에 발암 성. 가스 및 피부 접촉 유해 있습니다. -20 ° c.에 게 - Permeabilization 솔루션을 준비: 0.1 %1 x PBS에 트라이 톤 X-100. 솔루션의 100 ml, 1 x PBS의 100 mL에 Triton X-100의 100 µ L를 추가 합니다. 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.
- 워시 버퍼 준비: 1 x TBST입니다. 1 L, 10 x TBS의 100 mL, dH2O, 890 mL 및 트윈 20 (10%)의 10 mL를 가져가 라.
- 키트에 의해 제공 차단 솔루션을 준비 합니다. 또는 포함 하는 2% BSA 1 x PBS 솔루션 사용.
- 키트에 의해 제공 항 체 희석 액을 준비 합니다. 1 x PBS 솔루션 1 %BSA 포함 하는 또는 사용.
2입니다. 셀의 도금
참고: 이 연구에서 우리는 불멸 하 게 인간의 Schwann 세포 (iHSC)와 인간 미 발달 신장 293 세포 (HEK 293);를 사용 그러나, 많은 종류의 부착 세포에 대 한이 메서드를 사용할 수 있습니다.
- DMEM 10% 보충에서 HEK 293 문화 FBS, 0.2% 포도 당, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린 G과 5% CO2에서 37 ° C에서 조직 문화 취급 접시에 100 µ g/mL 스. 10 %FBS / DMEM 펜/Strep와 2 µ M 산림 보충 iHSC를 유지 합니다. Mycoplasma에 대 한 셀을 정기적으로 테스트 합니다. 셀 라인 인증 수행 되었다.
- 10 µ g/mL 자연 마우스 laminin 또는 0.01% 폴 리-L-리 신 솔루션의 50 µ L 16-잘 챔버 슬라이드 코트와 5% CO2에서 37 ° C에서 30 분 동안 품 어. 0.04% 트립 신-EDTA를 사용 하 여 셀을 분할 합니다.
- 플레이트 iHSC와 80% 합류 (15000-25000 셀/잘)에서 매체의 100 µ L에서 HEK 293.
- 12에 대 한 셀을 품 어-24 시간 37 ° c에서 습도, 5% CO2 배양 기.
3. 고정 및 Permeabilization
- 우물에서 매체를 제거 하 고 1 x PBS의 100 µ L로 씻어. 샘플을 제거의 위험을 최소화 하기 위해 micropipette와 발음.
- 4 %PFA 당 잘 동요 없이 RT에서 10 분 동안 품 어의 50 µ L을 추가 하 여 셀을 수정. 셀은 초연에 과민 하다, 그래서 pipetting 셀에 직접 솔루션을 피 한다.
- 0.05%로 세포 세척 TBST 5 분에 대 한 세 번. 샘플을 제거의 위험을 최소화 하기 위해 micropipette와 발음.
- Permeabilization 솔루션 (1 x PBS에 0.1% 트라이 톤 x-100) 셀 실시간에 동요 없이 10 분에 대 한 치료
- 동요와 함께 각 5 분에 대 한 세 번 TBST 가진 세포를 씻어.
4. 차단
- (아주 부드럽게 micropipette)으로 TBST를 누릅니다. 셀 연결 된 남아 볼 수 현미경에 슬라이드를 시각화 합니다.
- 차단 솔루션 x 1의 각 샘플 한 방울 (50-60 µ L)를 추가 합니다.
- 미리는 습기 (물으로 빈 팁 상자) 37 ° C에서 열 하 고 37 ° c.에 1 시간을 위해 그것에 슬라이드를 품 어
5. 1 차 항 체
- 항 체 희석제에 주 항 체 (1: 100)를 희석 ( 재료의 표참조). 잘 당 40 µ L 항 체 솔루션을 준비 합니다.
- 액체를 활용 하 여 슬라이드에서 차단 솔루션을 제거 합니다. 셀 건조를 허용 하지 않습니다.
- 와 동 항 체 해결책의 40 µ L 각 우물에 추가.
- 데워 습기에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.
6. 근접 결 찰 조사 분석 결과
참고: PLA 프로브는 키트의 일부로 제공 됩니다 ( 재료의 표참조). 프로브 선택은 관심사의 단백질을 검출 하는 데 사용 하는 기본 항 체의 종류에 따라 달라 집니다.
- 두 개의 PLA 프로브 (반대로 마우스 빼기와 반대로 토끼 플러스) 희석 1:5 항 체 희석제에. 각 샘플에 대 한 PLA 프로브의 40 µ L를 준비 합니다. 실시간 20 분을 위한 혼합물을 품 어
- 슬라이드에서 기본 항 체 솔루션을 누릅니다. 실시간에 두 번 세척 버퍼 각 5 분에 대 한 슬라이드를 세척
- 부드럽게 슬라이드에서 워시 버퍼의 누르고 우물 (40 µ L/잘)에 희석제 PLA 프로브 솔루션을 추가 합니다.
- 37 ° c.에 1 시간을 위한 미리가 열된 습도 챔버 슬라이드를 품 어
7입니다. 결 찰
참고: 현장에 검출 시 약 레드, 리가, 고 결 찰 솔루션 키트의 일부로 제공 됩니다 ( 재료의 표참조).
- 사용 현장에 검출 시 약 레드.
- 바로 전에 사용 하 여, 소용돌이 그리고 결 찰 사진 1: 5에 고 순도 물 x 5의 필요한 볼륨을 희석.
참고: 팬 들은 희석된 시 약의 정보를 저장 하지 마십시오. - 슬라이드에서 PLA 프로브 솔루션을 누릅니다. 워시 버퍼 두 번 5 분 마다 실시간 x 1에 슬라이드를 씻어
- 추가 샘플, 직전 소용돌이 1시 40분에서 결 찰 솔루션에 리가 추가 희석과 다시 소용돌이.
- 슬라이드에서 워시 버퍼에서 누르고 각 음 (40 µ L/잘)을 결 찰/리가 솔루션을 추가 합니다.
- 37 ° c.에 30 분을 위한 미리가 열된 습도 챔버 슬라이드를 품 어
8입니다. 증폭
참고: 증폭 재고 키트의 일부로 제공 됩니다 ( 재료의 표참조). 시 약은 빛에 민감한; 따라서 빛에 슬라이드를 노출 하지 마십시오.
- 소용돌이 필요한 볼륨 증폭 주식 고 순도 물에 1:5 x 5의 희석과 혼합.
- 슬라이드에서 결 찰/리가 솔루션을 누릅니다. 워시 버퍼 두 번 실시간 각 2 분 x 1에 슬라이드를 씻어
- 소용돌이 중 합 효소를 다시 1:80 희석 및 소용돌이에서 증폭 솔루션을 추가.
- 슬라이드에서 워시 버퍼에서 누르고을 각 영역 (40 µ L/잘) 증폭/중 합 효소 솔루션을 추가 합니다. 37 ° c.에 100 분을 위한 미리가 열된 습도 챔버 슬라이드를 품 어
9입니다. 영상에 대 한 준비
참고: 이들은 빛 민감한 시 약입니다. 슬라이드 빛 으로부터 보호 유지.
- 슬라이드에서 증폭-중 합 효소 솔루션을 누르고 실시간 워시 버퍼 x 각에 1 10 분 동안 두 번 씻어
- 제거 약 실 및 우물 주위 실리콘 슬라이드에서 완전히. 면도기와 실리콘의 나머지 비트를 다쳤어요. 각각을 분리 하는 슬라이드에 표를 그려 잘.
- DAPI와 장착 매체의 ~ 40 µ L를 추가 합니다. 트래핑 커버 슬립에서 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다. 커버 슬립의 가장자리는 매니큐어와 밀봉 될 수 있다.
- Confocal 현미경을 사용 하 여 이미지 분석을 수행 하기 전에 적어도 20 분을 기다립니다.
참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. - 이미징, 후 어둠 속에서-20 ° C에 슬라이드를 저장 합니다.
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Representative Results
우리는 HEK 293와 iHSC MST1와 MST2 사이 상호 작용을 테스트 하려면 PLA 분석 결과 사용. 셀 고정 했다, permeabilized, 및 다양 한 항 체, PLA 프로토콜 (그림 1)에 따라 현장에서 증폭 다음으로 물. MST1/MST2 heterodimerization의 수준을 문서화 하 셀 MST1와 MST2 항 체 (그림 1A, 1 C 및 1 G)으로 얼룩이 있었다. 긍정적인 통제로 우리 ERK 및 특권 항 체와 세포에 근접에 있을 것으로 예상 된다 (그림 1B 및 1 층) ERK 활성화. MST1와 MST2 셀 표시 PLA 신호 (그림 1C). 셀 두 항 체의 단 하나 물 마찬가지로 PLA 신호 (그림 1G)을 표시 합니다. 이 결과 HEK 293 세포, iHSC 세포 포함 MST1/MST2 heterodimers, 우리의 실험실4에서 이전 결과와 일치 하는 것이 좋습니다. 추가 부정적인 제어 신호 (그림 1D 및 1 시간)의 특이성을 보여 ERK 및 MST2 기본 항 체와 세포 incubated 우리.
WT에서 추출 하는 MST1 및 MST2 식의 레벨을 확인 하 고 MST1/MST2 녹아웃 HEK 293 세포, 각각, 표시 된 항 체 (그림 1I)와 immunoblot에 의해 분석 되었다.
그림 1 : 대표 PLA 데이터입니다. (A-H) 셀 고정 되었고 PLA 절차에 따라 지정 된 항 체와 스테인드. 블루: DAPI, 빨간색: PLA 신호. Photomicrographs는 Leica SP5 confocal 현미경으로 얻은 했다. (I) MST1와 MST2 위한 Immunoblot. 눈금 막대는 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 그것은 매우 편리 하 게 여러 (14-16) 셀 라인 실험을 수행 하 고 현미경 분석 하는 동안 모든 시간 샘플을 변경할 필요가 없습니다이 실험을 위해 유리 챔버 슬라이드를 사용 하 여 유용한 발견. 항 체와 교차 오염에 대 한 위험 증가 등, 몇 가지 합병증이 발생할 수 있습니다. 따라서, 우리는 것이 좋습니다 모든 잘 세척 실험의 증가 기간에도 불구 하 고 Coplin jar를 사용 하 여 대신 개별적으로. 또한, 실리콘 삽입의 제거는 섬세 한 일 이며 관심과 인 내 할 수 있어야 합니다. 도 세심 한 기술로, 그것은 때로는 제거 삽입 후 실리콘 파편의 작은 금액을 볼 수입니다. 이러한 이유로, 하나 제거 해야 합니다 실리콘 삽입 꼼꼼히, 필요한 경우 razorblade를 사용 하 여 너무 많은 unremoved 실리콘 동안 현미경 confocal 거리를 변경할 수 있습니다. 그것은 또한 현미경 셀을 찾을 수 있도록 실리콘 삽입을 제거한 후 우물의 국경으로 라인을 그릴 수 유용할 수 있습니다.
크로스 비 반응성 기본 항 체 각각에 heterodimer의 하나의 구성원 인식을 사용 하는 것이 필수적 이다 (예를 들어, 에서 MST1 항 체 한다 또한 인식 하지 MST2와 반대로). 또한, 그것은 1 차 항 체 및 PLA 프로브, 우물의 바닥을 만지지 마십시오 하 고 샘플을 통해 직접 pipetting 피하기 위하여의 교차 오염을 피하기 위해 다른 팁을 사용 하 여 기억 하는 것이 중요. 우리 iHSC에 대 한 그것은 코트 챔버 슬라이드 0.01% 폴 리-L-리 신 솔루션과 더 나은 그리고 HEK 293 그것은 마우스 10 µ g/mL laminin 코트 발견.
모든 프로시저와 마찬가지로이 방법의 몇 가지 제한이 있습니다. PLA 분석 결과 모든 이유로 강력한 방법을 상기 하면서 특이성 항 체의 감도 의해 제한 됩니다. 또한, 항 체 농도 및 세포 배양 조건 한다 정밀 하 게 조정 된 실험실 실험은 분석 실험의 비용을 줄이기 위해 설정 하기 전에. 그런 측면에서는 분석 실험의 비용을 줄이기 위해 대안 챔버 슬라이드 대신 uncoated 35 m m 유리 하단 접시를 사용 하는.
분석 결과의 한 장점은 그 강도 및 형광 도트 수 Blob 파인더 소프트웨어, Duolink 이미지 도구, 회 등 다양 한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 양이 정해질 수 있다 Olink 생명 과학.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 최적화 및 특정 마리아 Radu 갈리 나 Semenova에서이 프로토콜의 검증에 기여에 대 한 전체 Chernoff 연구소 감사. 우리는 또한 세포 이미징 시설 폭스 체이스 암 센터의 안드레이 Efimov 감사합니다. 이 작품은 JC (R01 CA148805) NIH에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
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- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
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- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
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- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
