Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Summary

La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.

Abstract

L’obésité s’accompagne d’un vaste remodelage du tissu adipeux principalement par l’intermédiaire de l’hypertrophie adipocytaire. Adipocyte extrême croissance résulte en une mauvaise réponse à l’insuline, l’hypoxie locale et l’inflammation. En stimulant la différenciation des adipocytes blancs fonctionnels de progéniteurs, hypertrophie radicale de la population d’adipocytes peut être évitée et, par conséquent, la santé métabolique du tissu adipeux peut être améliorée ainsi qu’une réduction de inflammation. En outre, en stimulant une différenciation des adipocytes beige/brun, la dépense d’énergie totale du corps peut être augmentée, entraînant une perte de poids. Cette approche pourrait prévenir le développement de co-morbidité de l’obésité comme les maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2.

Cet article décrit l’isolement, l’expansion et la différenciation des adipocytes blancs et beiges d’un sous-ensemble de cellules endothéliales de tissu adipeux humain qui expriment conjointement les marqueurs CD31 et CD34. La méthode est relativement bon marchée et n’est pas beaucoup de travail. Il requiert l’accès aux tissus adipeux humains et le dépôt sous-cutané est adapté pour l’échantillonnage. Pour ce protocole, les tissus adipeux frais échantillons provenant de sujets souffrant d’obésité morbide [indice de masse corporelle (IMC) > 35] sont collectées pendant les procédures de chirurgie bariatrique. À l’aide d’une immunoseparation séquentielle de la fraction stroma vasculaire, suffisamment de cellules est produites à aussi peu que 2 à 3 g de matières grasses. Ces cellules peuvent être développés en culture sur une période de 10 à 14 jours, peuvent être cryoconservés et conservent leurs propriétés adipocytaire avec passage jusqu’à passage 5-6. Les cellules sont traitées pendant 14 jours avec un cocktail à l’aide d’une combinaison de l’insuline humaine et l’agoniste-rosiglitazone PPARγ adipocytaire.

Cette méthode peut être utilisée pour l’obtention de preuve d’expériences de notion sur les mécanismes moléculaires qui animent les réponses adipocytaire dans les cellules endothéliales adipeuses, ou pour le dépistage des nouveaux médicaments qui peuvent augmenter l’adipocytaire réponse dirigée soit vers le blanc ou différenciation adipocytaire beige/marron. À l’aide de petites biopsies sous-cutanée, cette méthodologie permet d’écarter les sujets non-répondeur pour des essais cliniques visant à stimuler les adipocytes beige/marron et blancs pour le traitement de l’obésité et les comorbidités.

Introduction

Des données récentes montrent que, chez les souris et chez l’homme, un sous-ensemble de cellules résidant dans la vascularisation du tissu adipeux peut être différencié en soit les adipocytes blancs ou beige/marron^1,2,3. Le phénotype de ces cellules est un sujet de controverse, avec preuves à l’appui des cellules endothéliales, musculaires lisses/pericyte ou un spectre de phénotypes intermédiaires^4,5,6,7. Le champ d’application de cette méthodologie de développement était de tester le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales isolées de différents dépôts gras contre les hommes obèses. D’autres études dans la littérature mettent l’accent sur le potentiel de la fraction totale de vasculaire stromale ou des progéniteurs adipocytaires connu^2,8,9adipocytaire. Étant donné que les technologies existantes peuvent cibler spécifiquement les cellules endothéliales tissu adipeux pour drogue livraison¹⁰, compréhension du potentiel de ces cellules à subir adipocytaire induction vers les adipocytes blancs ou beiges est importante pour futures thérapies ciblées.

Différents groupes ont signalé la combinaison de marqueurs CD31 et CD34 comme substituts pour isoler les cellules endothéliales du tissu adipeux humain^11,12,13. En règle générale, l’isolement est effectuée à l’aide de deux étapes séquentielles et une sélection positive à l’aide de billes magnétiques. Dans ce rapport, immunoseparation à l’aide de CD34 + billes magnétiques combinés avec des perles en plastique CD31 a été utilisée. Nous avons constaté que cette technique est supérieure à l’immunoseparation magnétique séquentielle en ce qui concerne la conservation de la morphologie endothéliale pavées typiques. Aussi, nous étions en mesure de produire suffisamment de cellules nécessaires à l’expansion et adipocytaire induction à partir d’aussi peu que 1 à 2 g de matières grasses. Une biopsie du petit échantillon de graisse sous-cutanée est suffisant pour produire la quantité requise de cellules pour les applications en aval. Cet aspect est potentiellement important, surtout si cette méthode sera utilisée pour le dépistage d’une réactivité à induction adipocytaire chez des sujets humains.

Contrairement aux autres systèmes rapportés dans la littérature, cette méthode utilise seulement deux ingrédients pour l’induction adipocytaire des cellules CD34 + CD31 + : un agoniste PPARγ — rosiglitazone — et l’insuline humaine. Ce qui est important, la quantité d’insuline utilisée correspond à la fourchette de normale/haute de circulation insuline post-absorptif chez les humains,¹⁴. Le degré de sensibilité à l’insuline du cellules in vitro, mesurée par la phosphorylation de l’Akt, n’est pas corrélée avec leur capacité de répondre à l’induction cocktail. Fait intéressant, un mélange de blancs et beige/marron de cellules en utilisant des conditions expérimentales et cocktail cette induction, ont été obtenues tel que déterminé par la taille et le nombre de gouttelettes de lipides intracellulaires et l’expression des marqueurs moléculaires. Ce protocole d’induction simple et rentable ainsi que l’évaluation quantitative du phénotype des cellules répondeur (blanc ou beige) permet un dépistage d’agents qui peuvent potentiellement modifier l’équilibre du beige différenciée : blanc d’adipocytes.

Cette méthode fournit également une approche translationnelle pour comprendre les mécanismes sous-jacents de l’adipogenèse des progéniteurs endothéliales vasculaires dans le tissu adipeux humain. Utilisant cette technique d’isolation/différenciation spécifique, les enquêteurs peuvent interroger diverses voies chargées de l’adipogenèse dans un sous-ensemble de cellules endothéliales vasculaires de différents dépôts de graisse chez l’homme maigre et obèses.

Protocol

Le Comité d’examen institutionnel à Eastern Virginia Medical School a approuvé la recherche et la collecte d’échantillons de tissus adipeux humains utilisés dans l’étude. Consentement éclairé par écrit ont été recueilli chez les patients. 1. préparation des tampons, des médias et Instruments Préparer une Solution de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS) : 135 mM chlorure de sodium, chlorure de potassium de 5 mM, 1 mM sulfate de magnésium, 0,4 mM de phosphate…

Representative Results

Notre protocole vise à fournir une approche in vitro afin de déterminer le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules vasculaires de différents dépôts de tissus adipeux humains. Un diagramme de l’organigramme simplifié est montré dans la Figure 1 a. La première étape à l’aide d’une sélection positive de CD34 exprimant des cellules entraîne > 95 % cellules CD34 + dans la population des cellules fraîchement isolées (<stron…

Discussion

L’objectif de cet article est de fournir une méthodologie pour l’isolement, l’agrandissement et l’induction adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales de dépôts viscérales et sous-cutanée du tissu adipeux humain.

Méthodologies ont été rapportés pour l’isolement des cellules endothéliales de différents lits vasculaires des rongeurs ou des humains qui impliquent principalement les techniques utilisant des anticorps CD31 fluorescent étiquetés ou couplée à d…

Materials

Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484