בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן
Summary
הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.
Abstract
השמנת יתר מלווה של שיפוץ נרחב של רקמת שומן בעיקר דרך adipocyte היפרטרופיה. צמיחה adipocyte קיצוניים גורמת תגובה המסכן אינסולין, היפוקסיה המקומי של דלקת. על ידי המרצת את הבידול של adipocytes לבן פונקציונלי של אבות, היפרטרופיה הרדיקלית של האוכלוסייה adipocyte ניתנת למניעה, כתוצאה מכך, ניתן לשפר את הבריאות המטבולית של רקמת שומן יחד עם הפחתה של דלקת. כמו כן, על ידי גירוי של הבידול של חום בז/adipocytes, הוצאות האנרגיה של הגוף הכולל ניתן להגדיל, וכתוצאה מכך ירידה במשקל. גישה זו יכולה למנוע ההתפתחות של השמנת יתר morbidities שיתוף כגון סוכרת מסוג 2 ומחלות לב וכלי דם.
מאמר זה מתאר את הבידוד הרחבה, הבידול של adipocytes לבן ובייז של תת-קבוצה של רקמת שומן אנושי תאי אנדותל המבטאים במשותף את סמני CD34 ו- CD31. השיטה הוא זול יחסית ואינו מהגידולים. זה דורש גישה אנושית רקמת שומן ומתאים בתחנה תת עורית הדגימה. עבור פרוטוקול זה, רקמת שומן טריים דגימות מן הנבדקים חולנית [אינדקס מסת הגוף (BMI) > 35] נאספים במהלך הליכי ניתוח בריאטרי. שימוש של immunoseparation רציפים של השבר בכלי הדם סטרומה, מספיק תאים מיוצרים מ קטנה כמו 2-3 גרם של שומן. תאים אלה ניתן להרחיב בתרבות במשך 10-14 ימים, יכול להיות cryopreserved, שומרים על תכונותיהם adipogenic עם passaging עד מעבר 5-6. התאים מטופלים במשך 14 ימים עם קוקטייל באמצעות שילוב של אינסולין אנושי ואגוניסט-רוזיגליטזון את PPARγ adipogenic.
מתודולוגיה זו יכול לשמש להשגת הוכחת הרעיון ניסויים על המנגנונים המולקולריים לנהוג adipogenic תגובות בתאי האנדותל אדיפוז, או לסינון תרופות חדשות זה יכולה לשפר את adipogenic של תגובה מכוונת גם כלפי לבן או adipocyte חום בז/בידול. באמצעות ביופסיות תת-עורי קטן, מתודולוגיה זו ניתן לסנן נושאים שאינם-למגיב לניסויים קליניים שמטרתם לעורר adipocytes בז/חום ולבן לטיפול של השמנת יתר, שיתוף morbidities.
Introduction
לאחרונה מעידים כי הן בעכברים ובבני אדם, קבוצת משנה של תאים המתגוררים להערכת רקמת שומן יכול להיות מובחן גם2,1,adipocytes לבן או חוםבז/3. פנוטיפ תאים כאלה היא נושא למחלוקת, עם ראיות התומכות תאי אנדותל, שריר חלק/pericyte או קשת של פנוטיפים ביניים4,5,6,7. היקף פיתוח מתודולוגיה זו היה לבחון את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + תאי אנדותל מבודד מן המחסנים שומן שונה מבני מהשמנת יתר. מחקרים אחרים בספרות מתמקדים adipogenic הפוטנציאליים של השבר בכלי הדם סטרומה הכולל או של8,92,אבות adipocyte הידוע. מאז הטכנולוגיה הקיימת כיום ניתן לייעד באופן ספציפי רקמת שומן בתאי אנדותל עבור משלוח סמים10, להבין את הפוטנציאל של תאים כאלה לעבור adipogenic אינדוקציה לכיוון adipocytes לבן או בז הוא חשוב טיפולים ממוקדים בעתיד.
קבוצות שונות דיווחו על השילוב של סמני CD34 ו- CD31 כתחליף בידוד תאי אנדותל של רקמת שומן אנושי11,12,13. בדרך כלל, הבידוד מתבצעת באמצעות שני שלבים רציפים ומבחר חיובי באמצעות beads מגנטי. בדו ח זה, immunoseparation באמצעות CD34 + beads מגנטי בשילוב חרוזי פלסטיק CD31 היה מנוצל. מצאנו שיטה זו נעלה immunoseparation מגנטי רציפים ביחס לשימור מורפולוגיה אנדותל המרוצף טיפוסי. כמו כן, הצלחנו לייצר מספיק תאים הדרושים עבור אינדוקציה הרחבה, adipogenic החל מ קטנה כמו 1-2 גרם של שומן. ביופסיה מדגם קטן של שומן תת עורי מספיקה כדי לייצר את הכמות הנדרשת של תאים עבור יישומים במורד הזרם. היבט זה חשוב שעשוי להיות, במיוחד אם תשתמש בשיטה זו להקרנה על היענות אינדוקציה adipogenic של ניסויים.
בניגוד למערכות אחרות דיווחו בספרות, שיטה זו משתמשת רק שני מרכיבים אינדוקציה adipogenic CD34 + CD31 + תאים: אגוניסט PPARγ — רוזיגליטזון —, אינסולין אנושי. חשוב מכך, כמות האינסולין משמש נופל בטווח נורמלי/גבוהה של מחזורי אינסולין post-absorptive בני14. מידת ההיענות לאינסולין של ה תאי במבחנה, נמדד על ידי זרחון Akt, לא לתאם את יכולתם להגיב אינדוקציה קוקטייל. מעניין, באמצעות תנאים קוקטיילים ו ניסיוני זה אינדוקציה, שילוב של לבן, חום בז/תאים התקבלו כפי שנקבע בהתאם לגודלו, מספרים של השומנים תאיים טיפות, הביטוי של סמנים מולקולריים. פרוטוקול זה אינדוקציה פשוטה וחסכונית יחד עם הערכה כמותית של פנוטיפ של התאים למשיב (לבן לעומת בז) מאפשר הקרנה של סוכנים פוטנציאלי יכול לשנות את האיזון של בז הבדיל : לבן adipocytes.
שיטה זו מספקת גם בגישה translational להבנת המנגנון הבסיסי של adipogenesis של אבות אנדותל כלי הדם ברקמת שומן אנושי. באמצעות טכניקה ספציפית בידוד/בידול זו, החוקרים שניתן לחקור מסלולים שונים אחראים adipogenesis בקבוצת משנה של תאי אנדותל כלי הדם מן המחסנים שומן שונות אצל בני אדם רזה והשמנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
המוקד של מאמר זה נועד לספק מתודולוגיה עבור בידוד, הרחבה adipogenic אינדוקציה של CD34 + CD31 + תאי אנדותל של מחסני מהבטן, תת עורית של רקמת שומן אנושי.
מתודולוגיות דווחו על בידוד תאי אנדותל של מיטות נימי הדם השונים של מכרסמים או בני אדם המערבות טכניקות בעיקר באמצעות נוגדנים CD31 או fluorescently …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר בקי מרקז, למתאמת הקלינית במרכז Bariatric Sentara, על הסיוע עם התהליך של החולה ההקרנה ואני מסכים. מחקר זה נתמך על ידי R15HL114062 כדי Dobrian ד לימור קלו.
Materials
|
Large Equipment |
|||
|
Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
|
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
|
Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
|
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
|
Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
|
KRBSS Buffer |
|||
|
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
|
Tissue Digestion |
|||
|
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
|
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
|
Cell Isolation |
|||
|
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
|
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
|
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
|
Cell Culture |
|||
|
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
|
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
|
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
|
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
|
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
|
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
|
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
|
Cell Analysis |
|||
|
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
|
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
|
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
|
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
|
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
|
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
|
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
|
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
|
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
|
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
|
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
|
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
|
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
|
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
Referências
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human ‘brite/beige’ adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance–mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
