À Situ Microscopie pour la détermination en temps réel de la morphologie monocellulaire dans les bioprocessus
Summary
Un dispositif de microscopie in situ photo-optique a été développé pour surveiller la taille des cellules simples directement dans la suspension cellulaire. La mesure en temps réel est effectuée en couplant la sonde stérilisable photo-optique à une analyse automatisée de l’image. Des changements morphologiques apparaissent avec la dépendance à l’état de croissance et aux conditions de culture.
Abstract
La surveillance in situ des bioprocessus microbiens se limite principalement aux propriétés chimiques et physiques du milieu(p. ex.la valeur du pH et la concentration d’oxygène dissous). Néanmoins, la morphologie des cellules peut être un indicateur approprié pour des conditions optimales, car elle change avec la dépendance à l’état de croissance, l’accumulation de produit et le stress cellulaire. En outre, la distribution de la taille d’une seule cellule fournit non seulement des informations sur les conditions de culture, mais aussi sur l’hétérogénéité de la population. Pour obtenir de telles informations, un dispositif de microscopie in situ photo-optique1 a été développé pour permettre la surveillance de la distribution de taille d’une seule cellule directement dans la suspension cellulaire dans les bioréacteurs. Une analyse automatisée de l’image est couplée à la microscopie basée sur un modèle de réseau neuronal, qui est formé avec des images annotées par l’utilisateur. Plusieurs paramètres, qui sont tirés des captures du microscope, sont corrélés au processus des caractéristiques pertinentes des cellules, comme leur activité métabolique. Jusqu’à présent, la série de sondes de microscopie in situ présentée s’appliquait pour mesurer la taille des granulés dans les suspensions de champignons filamenteuses. Il a été utilisé pour distinguer la taille d’une cellule unique dans la culture des microalgues et de le relier à l’accumulation de lipides. La forme des particules cellulaires était liée au bourgeonnement dans les cultures de levure. L’analyse de la microscopie peut généralement être divisée en trois étapes : (i) l’acquisition d’images, (ii) l’identification des particules et (iii) l’analyse des données, respectivement. Toutes les étapes doivent être adaptées à l’organisme, et donc des informations annotées spécifiques sont nécessaires afin d’obtenir des résultats fiables. La capacité de surveiller les changements dans la morphologie cellulaire directement en ligne ou en ligne (dans un contournement) permet des valeurs en temps réel pour la surveillance et le contrôle, dans le développement des processus ainsi que dans l’échelle de production. Si les données hors ligne sont en corrélation avec les données en temps réel, les mesures hors ligne fastidieuses actuelles avec des influences inconnues sur la taille de la cellule deviennent inutiles.
Introduction
Les caractéristiques morphologiques des cellules sont souvent liées à l’état physiologique, un lien entre la forme et la fonction existe pour de nombreuses applications. La morphologie d’une seule cellule est influencée par l’état de croissance, l’âge de la cellule, les contraintes osmotiques et autres contraintes cellulaires potentielles ou l’accumulation de produits. Les changements morphologiques des cellules sont souvent une mesure de la vitalité de croissance d’une culture. La synthèse intracellulaire des produits, l’accumulation de lipides dans les algues et la formation du corps d’inclusion dans les bactéries, entre autres, sont également liées à la taille des cellules. L’agglomération cellulaire peut être un autre facteur qui vaut la peine d’être étudié tel que résumé récemment2.
Les hétérogénéités de population peuvent être quantifiées en fonction des caractéristiques morphologiques des cellules individuelles. Des études ont montré que l’hétérogénéité au sein d’une culture pouvait être significative, par exemple,dans des conditions de production à grande échelle3 le rendement global pourrait être affecté par une faible performance des sous-populations4.
Habituellement, l’évaluation des caractéristiques morphologiques des cellules est effectuée par échantillonnage manuel ou avec une chambre de contournement couplée à un dispositif photo-optique. Cela conduit à plusieurs restrictions : la quantité limitée de données acquises peut difficilement fournir des mesures statistiquement fiables ; le délai entre l’échantillonnage et l’accessibilité des résultats peut être trop long par rapport à la dynamique du processus; et le plus important, la procédure d’échantillonnage (emplacement du port d’échantillonnage, prétraitement de l’échantillon avant la mesure, conditions défavorables dans le tube d’échantillonnage ou de dérivation) peut déclencher une erreur biaisée car la procédure de l’échantillon elle-même peut déjà affecter les cellules Morphologie. Enfin, il existe toujours un risque élevé de contamination lors de l’échantillonnage ou dans les solutions de contournement, si elles ne sont pas stérilisables en place.
L’application de la microscopie in situ (ISM) peut contourner plusieurs de ces problèmes. Si les cellules sont détectées automatiquement, une identification correcte de leurs caractéristiques morphologiques peut être étudiée5. Jusqu’à présent, les principales limites de cette méthode étaient (i) le temps d’évaluation des images, qui était trop long pour les applications in situ, et (ii) la mauvaise résolution des images, en particulier à des densités cellulaires élevées. Bien que les premières solutions de l’ISM inclus l’échantillonnage mécanique, la dilution de la sonde, ou ont été limités à un système de contournement6,7, d’autres approches permettent la capture de la suspension cellulaire directement8.
Les progrès récents de l’ISM permettent la surveillance en ligne ou en ligne des cellules sur une base unicellulaire, ce qui permet la distribution de paramètres morphologiques en temps réel directement dans les suspensions cellulaires à des concentrations cellulaires considérablement élevées. Grâce à des analyses hors ligne des paramètres clés des cellules, des corrélations avec les informations fournies par la détection cellulaire automatisée couplée et l’ISM peuvent être identifiées. Ensuite, de nouvelles conceptions de capteurs souples sont réalisées, dans lesquelles un paramètre incommensurable est estimé avec la morphologie unicellulaire.
Dans ce rapport, l’ISM est réalisé en couplant une sonde photo-optique à une analyse d’image automatisée. L’ISM se compose d’une sonde de capteur à une tige qui permet la capture d’images dans une plage de mise au point connue dans un espace de mesure réglable avec une caméra CCD haute résolution [MM-Ho – CCD GT2750 (2750×2200) et MM 2.1 – CMOS G507c (2464×2056)]. L’éclairage de la lumière du flash est effectué par transmission. Par conséquent, la lumière provient du côté opposé de la caméra9 et son intensité peut être ajustée. Les cellules passent continuellement à travers cette lacune avec le flux liquide. Par conséquent, un échantillon représentatif de population est obtenu. La sonde peut être montée directement sur le bioréacteur de sorte qu’elle atteint dans la suspension cellulaire, ou il peut être utilisé dans un by-pass stérilisable. La coque du capteur est connectée au système avant la stérilisation, les pièces optiques sont ensuite montées dans la coquille.
Jusqu’à présent, les micro-organismes industriels pertinents, par exemple,les champignons filamenteux (diamètre de plus de 200 m), les microalgues hétérotrophes Crypthecodinium cohnii (diamètre cellulaire moyen de 20 m), et la levure Saccharomyces cerevisiae (diamètre cellulaire moyen de 5 m), ont été étudiés avec ce dispositif ou similaire, qui est peu décrit.
Les champignons filamenteux ont tendance à former des granulés dans certaines conditions de culture. Celles-ci sont d’une taille allant jusqu’à plusieurs centaines de m. Les hyphes des cellules fongiques développent différentes longueurs dans la dépendance au stress hydrodynamique dans la phase fluide. Cela a une influence sur l’activité métabolique et de croissance, l’apport de substrat et la libération du produit. L’ISM a été appliqué pour identifier la répartition de la taille des granulés et la largeur des zones de faible densité de biomasse aux bords des granulés (données inédites).
La taille de C. cohnii change entre 15 et 26 m lorsque les cellules accumulent l’acide docosahexaénoïque polyinsaturé (DHA) sous limitation d’azote. Ce processus de production biotechnologique de DHA se compose de deux parties, la phase de croissance, dans laquelle les cellules se divisent et deviennent plus petites, et la phase de production, dans laquelle les cellules accumulent le produit et deviennent ainsi plus grandes. Par conséquent, la taille de la cellule a été utilisée pour déterminer l’état du processus, dans lequel la croissance ou la production de DHA était favorable. Enfin, une corrélation entre la taille de la cellule et le contenu DHA a été trouvée. Dans ce cas, ISM permet de surveiller l’accumulation intracellulaire de DHA en temps réel sans l’exigence de l’échantillonnage, la perturbation cellulaire, et l’analyse commune de chromatographie de gaz10.
La levure en herbe est généralement d’une taille comprise entre 3 et 8 m. La proportion de cellules qui sont dans l’état de maturation à la fois, comme décrit avec l’indice en herbe (BI), fournit des informations sur la vitalité de la croissance11,12, et même une relation avec la sécrétion de protéines recombinantes a étéprouvé13. Avec l’aide de l’ISM, les cellules de levure en herbe et non-budding (cellules avec et sans bourgeon) ont été distingués14. Les conditions de stress peuvent également conduire à une plus grande variation de la taille des cellules au sein d’une population de levures, comme l’ont montré récemment les cultures à l’échelle, dans lesquelles les conditions de grandes cultures à teneur en eau à teneur limitée en nutriments ont été imitées3.
Par conséquent, l’ISM a le potentiel de surveiller la vitalité de la croissance et la formation de produits au niveau d’une seule cellule à toutes les étapes d’un bioprocessus pour l’identification de conditions de culture optimales, ou aux fins de contrôle des processus. Les méthodes décrites ici sont axées sur les applications microbiennes avec des cellules individuelles, mais sont également applicables aux particules plus grosses comme les cellules humaines et animales, les agglomérats cellulaires et les granulés d’organismes filamenteux.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ISM tel qu’il est présenté ici avec les mêmes dispositifs ou très similaires a été utilisé pour mesurer la dynamique morphologique des champignons, des microalgues et des cellules de levure, ce qui a permis de déterminer l’activité de croissance, et en cas d’algues, l’accumulation intracellulaire des produits. Le capteur n’a pas de pièces mobiles et est directement applicable dans n’importe quel bioréacteur de réservoir remué standard, soit par un port standard ou dans un contournement stérilisable. Puisq…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien du ministère fédéral allemand de l’économie et de l’énergie dans le cadre ZIM-Koop, projet “Inspection intelligente des processus”, subvention non. ZF 4184201CR5.
Materials
| Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
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