In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi
Summary
Bir foto-optik in situ mikroskopi cihazı doğrudan hücre süspansiyon tek hücrelerin boyutunu izlemek için geliştirilmiştir. Gerçek zamanlı ölçüm, foto-optik sterilize edilebilir probun otomatik görüntü analizine dahil edilerek gerçekleştirilir. Morfolojik değişiklikler büyüme durumuna ve yetiştirme koşullarına bağımlılıkla birlikte ortaya çıkmaktadır.
Abstract
Mikrobiyal biyoproseslerde yerinde izleme çoğunlukla ortamın kimyasal ve fiziksel özellikleriyle sınırlıdır(örn.pH değeri ve çözünmüş oksijen konsantrasyonu). Bununla birlikte, hücrelerin morfolojisi en uygun koşullar için uygun bir gösterge olabilir, çünkü büyüme durumuna bağımlılık ile değişir, ürün birikimi ve hücre stresi. Ayrıca, tek hücreli boyut dağılımı sadece yetiştirme koşulları hakkında değil, aynı zamanda nüfus heterojenliği hakkında da bilgi sağlar. Bu tür bilgileri elde etmek için, biyoreaktörlerde tek hücreli boyut dağılımının doğrudan hücre süspansiyonunda izlenmesini sağlamak için situ mikroskopi cihazı1 foto-optik geliştirilmiştir. Otomatik görüntü analizi, kullanıcı açıklamalı görüntülerle eğitilmiş bir sinir ağı modeline dayalı mikroskopiile birleştirilir. Mikroskobun ele geçirilmesinden elde edilen çeşitli parametreler, metabolik aktivite gibi hücrelerin ilgili özellikleriyle ilişkilidir. Şimdiye kadar, ipliksi mantar süspansiyonlarında pelet boyutunu ölçmek için situ mikroskopi prob serisi sunulmuştur. Mikroalg yetiştiriciliğinde tek hücreli boyutu ayırt etmek ve lipid birikimi ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Hücresel parçacıkların şekli maya kültürleri tomurcuklanma ile ilgiliydi. Mikroskopi analizi genellikle üç adıma ayrılabilir: (i) görüntü edinimi, (ii) parçacık tanımlama ve (iii) veri analizi, sırasıyla. Tüm adımlar organizmaya adapte edilmelidir ve bu nedenle güvenilir sonuçlar elde etmek için özel açıklamalı bilgi gereklidir. Hücre morfolojisindeki değişiklikleri doğrudan satır veya satır (by-pass olarak) izleme yeteneği, süreç geliştirme de ve üretim ölçeğinde izleme ve kontrol için gerçek zamanlı değerler sağlar. Çevrimdışı veriler gerçek zamanlı verilerle ilişkiliyse, hücre boyutu üzerinde bilinmeyen etkilere sahip geçerli sıkıcı çevrimdışı ölçümler gereksiz hale gelir.
Introduction
Hücrelerin morfolojik özellikleri genellikle fizyolojik durum ile ilgilidir, form ve fonksiyon arasında bir bağlantı birçok uygulama için var. Tek bir hücrenin morfolojisi büyüme durumu, hücrenin yaşı, ozmotik ve diğer potansiyel hücre gerilmeleri veya ürün birikimi nden etkilenir. Hücrelerin morfolojik değişiklikleri genellikle bir kültürün büyüme canlılığının bir ölçüsüdür. Hücre içi ürün sentezi, yosunlarda lipid birikimi ve bakterilerde dahil vücut oluşumu, diğerlerinin yanı sıra, hücre büyüklüğü ile de ilişkilidir. Hücre aglomerasyonu son zamanlarda özetlendiği gibi araştırmaya değer başka bir faktör olabilir2.
Popülasyon heterojeniteleri tek tek hücrelerin morfolojik özelliklerine göre ölçülebilir. Çalışmalar bir kültür içinde heterojenlik önemli olabileceğini gösterdi, örneğin,büyük ölçekli üretim koşulları altında3 genel verim alt popülasyonların düşük bir performans etkilenebilir4.
Genellikle, hücrelerin morfolojik özelliklerinin değerlendirilmesi manuel örnekleme veya bir foto-optik cihaza bağlı bir by-pass akış odası ile gerçekleştirilir. Bu çeşitli kısıtlamalara yol açar: elde edilen verilerin sınırlı miktarda neredeyse istatistiksel olarak güvenilir ölçümler sağlayabilir; örnekleme arasındaki zaman gecikmesi ve sonuçların erişilebilirliği sürecin dinamiklerine kıyasla çok uzun olabilir; ve en önemlisi, örnekleme prosedürü (numune portunun konumu, ölçümden önce numunenin ön işlemesi, örnekleme veya bypass tüpündeki elverişsiz koşullar) örnekleme işleminin kendisi hücreyi etkileyebileceğinden önyargılı bir hatayı tetikleyebilir Morfolojisi. Son olarak, numune alma sırasında veya by-pass çözeltilerinde sterilize edilebilen çözeltilerde her zaman yüksek kontaminasyon riski vardır.
in situ mikroskopi (ISM) uygulaması bu sorunların birkaçını atlatabilir. Hücreler otomatik olarak algılanırsa, morfolojik özelliklerinin doğru bir şekilde tanımlanması5. Şimdiye kadar, bu yöntemin ana sınırlamaları (i) yerinde uygulamalar için çok uzun olan görüntülerin değerlendirme süresi ve (ii) görüntülerin kötü çözünürlüğü, özellikle yüksek hücre yoğunluklarında idi. ISM’nin ilk çözümleri mekanik örnekleme dahil olmasına rağmen, prob seyreltme, ya da bir by-pass sistemi ile sınırlı ydı6,7, daha fazla yaklaşımlar doğrudan hücre süspansiyon yakalama sağlar8.
ISM’deki son gelişmeler, tek hücreli olarak hücrelerin satır içi veya satır da izlenmesine olanak sağlar, bu da morfolojik parametrelerin gerçek zamanlı olarak doğrudan hücre süspansiyonlarında önemli ölçüde yüksek hücre konsantrasyonlarında dağılımını sağlar. Hücrelerin anahtar parametrelerinin çevrimdışı analizleri sayesinde, birleşen otomatik hücre tespiti ve ISM tarafından sağlanan bilgilerle korelasyon lar tanımlanabilir. Daha sonra, tek hücreli morfolojisi ile ölçülemez bir parametrenin tahmin edildiği yeni yumuşak sensör tasarımları elde edilir.
Bu raporda, ISM otomatik bir görüntü analizi için bir foto-optik prob kaplayarak yapılır. ISM, yüksek çözünürlüklü CCD kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750×2200) ve MM 2.1 = CMOS G507c (2464×2056)]] ile ayarlanabilir bir ölçüm boşluğunda bilinen bir odak aralığındaki görüntülerin yakalanmasını sağlayan tek çubuklu bir sensör probundan oluşur. Flaş ışığı aydınlatması iletim ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, ışık kamera9 karşı tarafında kaynaklanır ve yoğunluğu ayarlanabilir. Hücreler sıvı akışı ile bu boşluktan sürekli olarak geçerler. Bu nedenle, temsili bir örnek popülasyon elde edilir. Prob doğrudan biyoreaktöre monte edilebilir, böylece hücre süspansiyonuna ulaşır veya sterilize edilebilir bir by-pass’ta kullanılabilir. Sensör kabuğu sterilizasyondan önce sisteme bağlanır, optik parçalar daha sonra kabuk içine monte edilir.
Şimdiye kadar, ilgili endüstriyel mikroorganizmalar, örneğin,ipliksi mantarlar (çapı 200 μm’ye kadar), heterotrofik mikroalg Crypthecodinium cohnii (ortalama hücre çapı 20 μm) ve maya Saccharomyces cerevisiae (ortalama hücre çapı 5 μm), kısa bir süre açıklanan bu veya benzeri cihazlarla incelenmiştir.
Filamentöz mantarlar belirli yetiştirme koşulları altında pelet oluşturma eğilimindedir. Bunlar birkaç yüz μm boyutundadır. Mantar hücrelerinin hyphae sıvı fazhidrodinamik strese bağımlılık farklı uzunluklarda geliştirmek. Bu metabolik ve büyüme aktivitesi üzerinde bir etkisi vardır, substrat alımı ve ürün salınımı. ISM pelet boyutu dağılımı ve pelet kenarlarında düşük biyokütle yoğunluğu bölgelerin in genişliğini belirlemek için uygulandı (kendi yayınlanmamış veri).
C. cohnii boyutu hücreleri azot sınırlaması altında çoklu doymamış yağ asidi dokosaheksaenoik asit (DHA) birikir zaman 15 ve 26 μm arasında değişir. Bu biyoteknolojik DHA üretim süreci iki bölümden oluşur, büyüme aşaması, hangi hücrelerin bölmek ve küçülür, ve üretim aşaması, hangi hücrelerin ürün birikir ve böylece daha büyük olur. Bu nedenle, hücre boyutu, büyüme veya DHA üretiminin olumlu olduğu işlem durumunu belirlemek için kullanılmıştır. Son olarak, hücre boyutu ve DHA içeriği arasında bir korelasyon bulundu. Bu durumda ISM, hücre içi DHA birikimini örnekleme, hücre bozulması ve ortak gaz kromatografisi analizi10gerekkalmadan gerçek zamanlı olarak izlemenizi sağlar.
Tomurcuklanan maya genellikle 3 ila 8 μm arasında bir boyuttadır. Tomurcuklanma indeksi (BI) ile açıklandığı gibi, bir anda olgunlaşma durumunda olan hücrelerin oranı, büyüme canlılığı hakkında bilgi sağlar11,12, ve hatta rekombinant protein salgısı ile bir ilişkikanıtlanmıştır 13. ISM yardımıyla, tomurcuklanan ve tomurcuklanmayan maya hücreleri (tomurcuklu ve tomurcuksuz hücreler)14ayırt edildi. Stres koşulları da bir maya popülasyoniçinde hücre boyutunun daha geniş bir varyasyon yol açabilir, son zamanlarda küçültülmüş ekimleri gösterildiği gibi, hangi büyük ölçekli besin sınırlı beslenen-toplu yetiştirme koşulları taklit edildi3.
Bu nedenle, ISM optimum yetiştirme koşullarının belirlenmesi için bir biyosürecin tüm aşamalarında tek hücre düzeyinde büyüme canlılığı ve ürün oluşumunu izlemek için potansiyele sahiptir, ya da süreç kontrolü amacıyla. Burada açıklanan yöntemler tek hücreli mikrobiyal uygulamalara odaklanmıştır, ancak insan ve hayvan hücreleri, hücre aglomeraları ve ipliksi organizmaların peletleri gibi daha büyük parçacıklar için de geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada aynı veya çok benzer cihazlarla sunulan ISM, mantarların, mikroalgların ve maya hücrelerinin morfolojik dinamiklerini ölçmek için kullanılmış, bu da büyüme aktivitesinin belirlenmesini ve alglerin hücre içi ürün birikimine yol açarak sağlanmıştır. Sensörün hareketli parçaları yoktur ve standart bir bağlantı noktası üzerinden veya sterilize edilebilir bir by-pass’ta herhangi bir standart karıştırılan tank biyoreaktöründe doğrudan uygulanabilir. Maya yosun çok daha küçük oldu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar çerçevesinde ZIM-Koop, proje “Akıllı Süreç Denetimi” kapsamında Almanya Federal Ekonomi ve Enerji Bakanlığı desteği için müteşekkir, hibe hayır. ZF 4184201CR5.
Materials
| Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
Referências
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. – Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
