في الموقع المجهر لتحديد في الوقت الحقيقي من المورفولوجية خليه واحده في العمليات الحيوية
Summary
تم تطوير جهاز مجهري للصور البصرية في الموقع لمراقبه حجم الخلايا المفردة مباشره في تعليق الخلية. يتم اجراء القياس في الوقت الحقيقي عن طريق اقتران المسبار البصري القابل لتعقيم الصور بتحليل تلقائي للصور. تظهر التغيرات المورفولوجية مع الاعتماد علي حاله النمو والظروف الزراعية.
Abstract
ويقتصر الرصد في الموقع في العمليات البيولوجية الميكروبية في الغالب علي الخواص الكيميائية والفيزيائية لهذه الوسيلة (مثلا، قيمه الأس الهيدروجيني وتركيز الأكسجين المذاب). ومع ذلك ، فان المورفولوجية من الخلايا يمكن ان يكون مؤشرا مناسبا للظروف المثلي ، لأنه يتغير مع الاعتماد علي حاله النمو ، وتراكم المنتجات والإجهاد الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان توزيع حجم الخلية الواحدة لا يوفر فقط معلومات عن ظروف الزراعة ، ولكن أيضا عن عدم تجانس السكان. وللحصول علي هذه المعلومات ، تمتطوير جهاز مجهري للصور البصرية في الموقع للتمكين من رصد توزيع حجم الخلية الواحدة مباشره في تعليق الخلية في المفاعلات الحيوية. ويقترن التحليل الألى للصور بالمجهر القائم علي نموذج الشبكة العصبية ، الذي يتم تدريبه باستخدام صور مشروحه من قبل المستخدم. وترتبط العديد من المعلمات ، والتي تكتسب من لقطات من المجهر ، لمعالجه الميزات ذات الصلة من الخلايا ، مثل نشاطهم الأيضي. حتى الآن ، تم تطبيق سلسله التحقيق المجهري المقدمة في الموقع لقياس حجم بيليه في تعليق الفطريات الخيطية. تم استخدامه لتمييز حجم الخلية الواحدة في زراعه الطحالب الدقيقة وربطها بتراكم الدهون. وكان شكل الجزيئات الخلوية المرتبطة في مهدها في ثقافات الخميرة. ويمكن تقسيم تحليل المجهر عموما إلى ثلاث خطوات: ‘ 1 ‘ اكتساب الصور ، ‘ 2 ‘ تحديد الجسيمات ، و ‘ 3 ‘ تحليل البيانات ، علي التوالي. ويتعين تكييف جميع الخطوات مع الكائن الحي ، التالي يلزم تقديم معلومات محدده مشروحه من أجل تحقيق نتائج موثوق بها. وتمكن القدرة علي رصد التغيرات في شكل الخلية مباشره في الخط أو علي الخط (بالمرور المباشر) القيم الانيه للرصد والمراقبة ، وفي تطوير العمليات وكذلك في نطاق الإنتاج. ان ال [أوت لين ] معطيات يرتبط مع ال [رل-تيم] معطيات, الحالية مملة من خط قياسات مع تاثيرات مجهوله علي الخلية حجم يصبح غنيه.
Introduction
وغالبا ما ترتبط الخصائص المورفولوجية للخلايا بالحالة الفسيولوجية ، وهناك اتصال بين الشكل والوظيفة للعديد من التطبيقات. ويتاثر تشكل الخلية الواحدة بحاله النمو ، وعمر الخلية ، والإجهادات الخلوية المحتملة الأخرى أو تراكم المنتجات. وغالبا ما تكون التغيرات المورفولوجية للخلايا مقياسا لحيوية نمو الثقافة. توليف المنتجات داخل الخلايا, تراكم الدهون في الطحالب وإدماج تشكيل الجسم في البكتيريا, من بين أمور أخرى, ترتبط مع حجم الخلية وكذلك. خليه تكتل يستطيع كنت أخرى عامل ان يكون جديرة يتحرى بما ان يلخص مؤخرا2.
يمكن تحديد كميه التغاير السكانية استنادا إلى الخصائص المورفولوجية للخلايا الفردية. وأظهرت الدراسات ان عدم التجانس داخل الثقافة قد يكون كبيرا ، علي سبيل المثال، في ظل ظروف الإنتاج الواسعة النطاق3 وقد يتاثر العائد الإجمالي بانخفاض أداء السكان الفرعيين4.
عاده ، يتم اجراء تقييم الميزات المورفولوجية من الخلايا عن طريق أخذ العينات اليدوية أو مع غرفه تدفق بتمريره إلى جانب جهاز الصور البصرية. وهذا يؤدي إلى عده قيود: فالكمية المحدودة من البيانات المكتسبة لا يمكن ان توفر قياسات موثوقه إحصائيا ؛ التاخير الزمني بين أخذ العينات والوصول إلى النتائج قد يكون طويلا جدا بالمقارنة مع ديناميات العملية ؛ والاهم من ذلك ، فان اجراء أخذ العينات (موقع ميناء أخذ العينات ، والمعالجة المسبقة للعينه قبل القياس ، والظروف غير المواتية في أخذ العينات أو أنبوب التفافيه) يمكن ان تؤدي إلى خطا متحيز كما الاجراء عينه نفسها يمكن ان تؤثر بالفعل علي الخلية مورفولوجيا. وأخيرا ، هناك دائما خطر كبير للتلوث اثناء أخذ العينات أو في حلول المرور ، إذا لم يتم تعقيمها في مكانها.
يمكن لتطبيق المجهر في الموقع (ISM) التفاف علي العديد من هذه المشاكل. إذا تم الكشف عن الخلايا تلقائيا ، يمكن مسح التعريف الصحيح لمعالمها المورفولوجية5. وحتى الآن ، كانت القيود الرئيسية لهذه الطريقة هي ‘ 1 ‘ وقت تقييم الصور ، الذي كان طويلا جدا بالنسبة للتطبيقات الموقعيه ، و ‘ 2 ‘ ضعف استبانه الصور ، ولا سيما في كثافة الخلايا العالية. علي الرغم من ان الحلول الاولي من ISM شملت أخذ العينات الميكانيكية, تخفيف المسبار, أو اقتصرت علي نظام بتمريره6,7, المزيد من النهج تسمح التقاط تعليق الخلية مباشره8.
التطورات الاخيره في ISM تسمح للخط في خط أو علي خط الرصد من الخلايا علي أساس خليه واحده ، والذي يوفر توزيع المعلمات المورفولوجية في الوقت الحقيقي مباشره في تعليق الخلية في تركيزات الخلية عاليه إلى حد كبير. ويمكن التعرف علي الارتباطات مع المعلومات المقدمة من خلال الكشف الألى المقترن بالخلايا والبيانات المتعلقة بالخلية عن طريق تحليلات الخطوط المتفرعة عن المعلمات الرئيسية للخلايا. ثم ، يتم تحقيق تصاميم جديده استشعار لينه ، والتي يتم تقدير المعلمة غير قابله للقياس مع المورفولوجية خليه واحده.
في هذا التقرير ، يتم اجراء ISM عن طريق اقتران مسبار الصور البصرية إلى تحليل الصورة الألى. ISM يتكون من المسبار الاستشعار قضيب واحد التي تمكن من التقاط الصور ضمن نطاق التركيز المعروف في فجوه قياس قابل للتعديل مع كاميرا CCD عاليه الدقة [مم-هو = CCD GT2750 (2750×2200) و MM 2.1 = CMOS G507c (2464×2056)]. يتم اجراء الاضاءه ضوء فلاش عن طريق الإرسال. لذلك ، يتكون الضوء من الجانب الآخر من الكاميرا9 ويمكن تعديل شدته. تمر الخلايا بشكل مستمر من خلال هذه الفجوة مع تدفق السائل. ومن ثم ، يتم الحصول علي عينه تمثيليه من السكان. المسبار يستطيع كنت شنت مباشره إلى ال [بيوكتور] [س ثت] هو يصل داخل الخلية تعليق, أو هو يستطيع كنت استعملت في معقمه [ب-تمر]. يتم توصيل قذيفة الاستشعار إلى النظام قبل التعقيم ، والأجزاء البصرية وبعد ذلك شنت في قذيفة.
حتى الآن ، والكائنات المجهرية الصناعية ذات الصلة ، علي سبيل المثال، الفطريات الخيطية (قطر تصل إلى أكثر من 200 μm) ، والطحالب غير المتجانسة crypthecodinium cohnii (متوسط قطر الخلية من 20 μm) ، والخميرة ساكاروميسز سيريفيسياي (متوسط قطر الخلية من 5 μm) ،
الفطريات الخيطية تميل إلى تشكيل الكريات تحت ظروف زراعه معينه. هذه هي من حجم يصل إلى عده مئات من μm. والخلايا الفطرية في الخلية تتطور أطوال مختلفه في الاعتماد علي الإجهاد الهيدروديناميكي في مرحله السوائل. هذا له تاثير علي نشاط الأيض والنمو, امتصاص الركيزة والإفراج عن المنتج. تم تطبيق ISM لتحديد توزيع حجم بيليه وعرض مناطق كثافة الكتلة الحيوية اقل علي حواف الكريات (البيانات غير المنشورة الخاصة).
حجم c. cohnii يغير بين 15 و 26 ميكرومتر عندما تتراكم الخلايا الأحماض الدهنية غير المشبعة docosahexاينويك حمض (DHA) تحت النيتروجين الحد. هذه العملية الحيوية لإنتاج DHA تتكون من جزاين ، مرحله النمو ، حيث تقسم الخلايا وتصبح أصغر ، ومرحله الإنتاج ، التي تتراكم فيها الخلايا المنتج التالي تصبح أكبر. ولذلك ، تم استخدام حجم الخلية لتحديد حاله العملية ، التي اما النمو أو إنتاج DHA كان مواتيه. وأخيرا ، تم العثور علي ارتباط بين حجم الخلية ومحتوي DHA. في هذه الحالة ، ISM يسمح لرصد تراكم DHA داخل الخلايا في الوقت الحقيقي دون شرط أخذ العينات ، وتعطيل الخلية ، وتحليل اللوني الغاز المشتركة10.
الخميرة في مهدها عاده من حجم بين 3 و 8 μm. نسبه الخلايا الموجودة في حاله النضج في وقت ما ، كما هو موضح مع المؤشر الناشئ (BI) ، توفر معلومات حول حيوية النمو11،12، وحتى علاقة مع إفراز البروتين المؤتلف قد ثبت13. مع مساعده من ISM ، في مهدها وغير الناشئة خلايا الخميرة (الخلايا مع وبدون برعم) وتميزت14. ظروف الإجهاد يمكن ان يؤدي أيضا إلى تباين أوسع من حجم الخلية داخل السكان الخميرة, كما هو مبين مؤخرا في زراعات النطاق الأسفل, التي كانت الظروف الواسعة النطاق المغذيات المحدودة التغذية-زراعات دفعه محاكاة3.
ولذلك ، فان ISM لديه القدرة علي رصد حيوية النمو وتكوين المنتجات علي مستوي خليه واحده خلال جميع مراحل العملية الحيوية لتحديد ظروف الزراعة المثلي ، أو لغرض التحكم في العملية. الطرق الموصوفة هنا تتركز علي التطبيقات الميكروبية مع خلايا واحده ، ولكنها تنطبق أيضا علي جزيئات أكبر مثل الخلايا البشرية والحيوانية ، اجلمرتر الخلايا والكريات من الكائنات الحية الخيطية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت ISM كما قدمت هنا مع نفس أو أجهزه مشابهه جدا لقياس ديناميات مورفولوجيك من الفطريات والطحالب المجهرية ، وخلايا الخميرة ، والتي مكنت تحديد نشاط النمو ، وفي حاله الطحالب ، تراكم المنتج داخل الخلايا. جهاز الاستشعار ليس لديه أجزاء المنقولة وقابله للتطبيق مباشره في اي معيار دبابة يحرك…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفات شاكره للدعم من الوزارة المانيه فيديرالية علم اقتصاد وطاقة ضمن الإطار [زيم-كووب], مشروع “ذكية عمليه تفتيش”, هبه لا. ZF 4184201CR5.
Materials
| Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
Referências
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. – Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
