In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen
Summary
Ein fotooptisches In-situ-Mikroskopiergerät wurde entwickelt, um die Größe einzelner Zellen direkt in der Zellsuspension zu überwachen. Die Echtzeitmessung erfolgt durch Kopplung der photooptischen sterilisierbaren Sonde an eine automatisierte Bildanalyse. Morphologische Veränderungen treten mit Abhängigkeit vom Wachstumszustand und den Anbaubedingungen auf.
Abstract
Die In-situ-Überwachung in mikrobiellen Bioprozessen beschränkt sich meist auf chemische und physikalische Eigenschaften des Mediums(z.B.pH-Wert und Die Konzentration auf gelöster Sauerstoff). Dennoch kann die Morphologie der Zellen ein geeigneter Indikator für optimale Bedingungen sein, da sie sich mit Abhängigkeit vom Wachstumszustand, der Produktakkumulation und der Zellspannung ändert. Darüber hinaus liefert die Einzelzellgrößenverteilung nicht nur Informationen über die Anbaubedingungen, sondern auch über die Heterogenität der Population. Um solche Informationen zu erhalten, wurde ein fotooptisches In-situ-Mikroskopiongerät 1 entwickelt, um die Überwachung der einzelzelligen Größenverteilung direkt in der Zellsuspension in Bioreaktoren zu ermöglichen. Eine automatisierte Bildanalyse wird an die Mikroskopie gekoppelt, die auf einem neuronalen Netzwerkmodell basiert, das mit benutzerkommentierten Bildern trainiert wird. Mehrere Parameter, die aus den Aufnahmen des Mikroskops gewonnen werden, werden mit prozessrelevanten Merkmalen der Zellen korreliert, wie ihre metabolische Aktivität. Bisher wurde die vorgestellte In-situ-Mikroskopie-Sondenserie zur Messung der Pelletgröße in fadenförmigen Pilzsuspensionen eingesetzt. Es wurde verwendet, um die einzellige Größe in der Mikroalgenkultivatierzukultivierung zu unterscheiden und sie mit der Lipidakkumulation in Beziehung zu setzen. Die Form der zellulären Teilchen war mit dem Aufblühen in Hefekulturen verbunden. Die Mikroskopieanalyse kann im Allgemeinen in drei Schritte unterteilt werden: (i) Bildaufnahme, (ii) Partikelidentifikation bzw. (iii) Datenanalyse. Alle Schritte müssen an den Organismus angepasst werden, und daher sind spezifische, mit Anmerkungen bestellte Informationen erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die Möglichkeit, Veränderungen in der Zellmorphologie direkt in der Linie oder im Internet (in einer Umgehungskarte) zu überwachen, ermöglicht Echtzeitwerte für Überwachung und Steuerung, in der Prozessentwicklung sowie im Produktionsmaßstab. Wenn die Off-Line-Daten mit den Echtzeitdaten korrelieren, werden die aktuellen mühsamen Off-Line-Messungen mit unbekannten Einflüssen auf die Zellgröße überflüssig.
Introduction
Morphologische Merkmale von Zellen hängen oft mit dem physiologischen Zustand zusammen, eine Verbindung zwischen Form und Funktion besteht für viele Anwendungen. Die Morphologie einer einzelnen Zelle wird durch den Wachstumszustand, das Alter der Zelle, osmotische und andere potenzielle Zellspannungen oder Produktakkumulation beeinflusst. Morphologische Veränderungen von Zellen sind oft ein Maß für die Wachstumsvitalität einer Kultur. Intrazelluläre Produktsynthese, Lipidansammlung in Algen und Inklusionkörperbildung in Bakterien, unter anderem, sind auch mit der Zellgröße verbunden. Zellagglomeration kann ein weiterer Faktor sein, der es wert ist, untersucht zu werden, wie kürzlich zusammengefasst2.
Populationsheterogenitäten können anhand morphologischer Merkmale einzelner Zellen quantifiziert werden. Studien zeigten, dass Heterogenität innerhalb einer Kultur signifikant sein kann, z. B.könnte unter großflächigen Produktionsbedingungen3 der Gesamtertrag durch eine geringe Leistung der Subpopulationen beeinflusst werden4.
In der Regel erfolgt die Beurteilung morphologischer Merkmale von Zellen durch manuelle Probenahme oder mit einer Anpass-Durchflusskammer, die an ein fotooptisches Gerät gekoppelt ist. Dies führt zu mehreren Einschränkungen: Die begrenzte Menge der erfassten Daten kann kaum statistisch zuverlässige Messungen liefern; die Zeitverzögerung zwischen der Probenahme und der Zugänglichkeit der Ergebnisse kann im Vergleich zur Dynamik des Prozesses zu lang sein; und am wichtigsten ist, dass das Probenahmeverfahren (Standort des Probenahmeports, Vorbehandlung der Probeprobe vor der Messung, ungünstige Bedingungen in der Probenahme oder im Bypass-Rohr) einen verzerrten Fehler auslösen kann, da das Probenverfahren selbst bereits die Zelle beeinflussen kann. Morphologie. Schließlich besteht immer ein hohes Kontaminationsrisiko bei der Probenahme oder bei Umgehungslösungen, wenn sie nicht sterilisierbar sind.
Die Anwendung der In-situ-Mikroskopie (ISM) kann mehrere dieser Probleme umgehen. Wenn Zellen automatisch erkannt werden, kann eine korrekte Identifizierung ihrer morphologischen Merkmale vermessen werden5. Bisher waren die Haupteinschränkungen dieser Methode (i) die Auswertungszeit von Bildern, die für In-situ-Anwendungen zu lang war, und (ii) die schlechte Auflösung von Bildern, insbesondere bei hoher Zelldichte. Obwohl erste Lösungen von ISM mechanische Probenahme, Verdünnung der Sonde oder waren auf ein Umgehungssystem6,7beschränkt, weitere Ansätze ermöglichen die Erfassung der Zellsuspension direkt8.
Jüngste Fortschritte im ISM ermöglichen die inline- oder online-Überwachung von Zellen auf Einzelzellbasis, die die Verteilung morphologischer Parameter in Echtzeit direkt in Zellsuspensionen bei erheblich hohen Zellkonzentrationen ermöglicht. Durch Off-Line-Analysen der Schlüsselparameter der Zellen können Korrelationen mit Informationen identifiziert werden, die durch die gekoppelte automatisierte Zellerkennung und ISM bereitgestellt werden. Dann werden neue Softsensor-Designs erreicht, bei denen mit der einzelligen Morphologie ein nicht messbarer Parameter geschätzt wird.
In diesem Bericht wird das ISM durch Koppelung einer photooptischen Sonde an eine automatisierte Bildanalyse durchgeführt. Die ISM besteht aus einer einstabigen Sensorsonde, die die Aufnahme von Bildern innerhalb eines bekannten Fokusbereichs in einem einstellbaren Messspalt mit einer hochauflösenden CCD-Kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750×2200) und MM 2.1 = CMOS G507c (2464×2056)] ermöglicht. Die Blitzlichtbeleuchtung erfolgt über die Übertragung. Daher stammt das Licht von der gegenüberliegenden Seite der Kamera9 und seine Intensität kann eingestellt werden. Zellen passieren diese Lücke kontinuierlich mit dem Flüssigkeitsfluss. Daher wird eine repräsentative Stichprobenpopulation ermittelt. Die Sonde kann direkt am Bioreaktor montiert werden, so dass sie in die Zellsuspension gelangt, oder sie kann in einem sterilisierbaren Bypass verwendet werden. Die Sensorhülle wird vor der Sterilisation mit dem System verbunden, die optischen Teile werden anschließend in die Schale montiert.
Bisher wurden relevante industrielle Mikroorganismen, z.B.fadenförmige Pilze (Durchmesser von bis zu über 200 m), die heterotrophen Mikroalgen Crypthecodinium cohnii (durchschnittlicher Zelldurchmesser von 20 m) und die Hefe Saccharomyces cerevisiae (durchschnittlicher Zelldurchmesser von 5 m) mit diesen oder ähnlichen Vorrichtungen untersucht, was kurz beschrieben wird.
Fadenförmige Pilze neigen dazu, Pellets unter bestimmten Anbaubedingungen zu bilden. Diese haben eine Größe von bis zu mehreren hundert m. Die Hyphen der Pilzzellen entwickeln unterschiedliche Längen in Abhängigkeit von der hydrodynamischen Belastung in der Fluidphase. Dies hat einen Einfluss auf die Stoffwechsel- und Wachstumsaktivität, substrataufnahme und Produktfreisetzung. ISM wurde angewendet, um die Pelletgrößenverteilung und die Breite von Zonen mit geringerer Biomassedichte an den Rändern der Pellets zu identifizieren (eigene unveröffentlichte Daten).
Die Größe von C. cohnii ändert sich zwischen 15 und 26 m, wenn Zellen die mehrfach ungesättigte Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) unter Stickstoffbegrenzung ansammeln. Dieser biotechnologische DHA-Produktionsprozess besteht aus zwei Teilen, der Wachstumsphase, in der sich Zellen teilen und kleiner werden, und der Produktionsphase, in der Zellen das Produkt ansammeln und dadurch größer werden. Daher wurde die Zellgröße verwendet, um den Prozesszustand zu bestimmen, in dem entweder Wachstum oder DHA-Produktion günstig war. Schließlich wurde eine Korrelation zwischen der Zellengröße und dem DHA-Inhalt gefunden. In diesem Fall ermöglicht ISM die Überwachung der intrazellulären DHA-Akkumulation in Echtzeit ohne die Notwendigkeit von Probenahme, Zellstörung und der gemeinsamen Gaschromatographie-Analyse10.
Budding Hefe ist in der Regel von einer Größe zwischen 3 und 8 m. Der Anteil der Zellen, die sich gleichzeitig im Reifezustand befinden, wie mit dem angehenden Index (BI) beschrieben, liefert Informationen über die Wachstumsvitalität11,12, und sogar eine Beziehung zur rekombinanten Proteinsekretion wurde13nachgewiesen. Mit Hilfe von ISM wurden angehende und nicht aufkeimende Hefezellen (Zellen mit und ohne Knospe)14unterschieden. Stressbedingungen können auch zu einer breiteren Variation der Zellgröße innerhalb einer Hefepopulation führen, wie kürzlich in scale-down-Kulturen gezeigt wurde, bei denen die Bedingungen für großflächige nährstoffbegrenzte Futter-Batch-Kulturen nachgeahmt wurden3.
Daher hat ISM das Potenzial, die Wachstumsvitalität und Produktbildung auf einzelzelliger Ebene in allen Phasen eines Bioprozesses zur Ermittlung optimaler Anbaubedingungen oder zum Zwecke der Prozesskontrolle zu überwachen. Die hier beschriebenen Methoden konzentrieren sich auf mikrobielle Anwendungen mit Einzelzellen, sind aber auch auf größere Partikel wie menschliche und tierische Zellen, Zellagglomerate und Pellets von fadenförmigen Organismen anwendbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
ISM, wie hier mit den gleichen oder sehr ähnlichen Geräten vorgestellt, wurde verwendet, um die morphologische Dynamik von Pilzen, Mikroalgen und Hefezellen zu messen, die die Bestimmung der Wachstumsaktivität und im Falle von Algen, intrazelluläre Produktakkumulation ermöglicht. Der Sensor hat keine beweglichen Teile und ist direkt in jedem Standard-Rührbehälter-Bioreaktor einsetzbar, entweder über einen Standardport oder in einem sterilisierbaren Bypass. Da Hefe viel kleiner als Algen ist, erforderte die Reduzi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie im Rahmen von ZIM-Koop, Projekt “Smart Process Inspection”, Zuschuss Nr. ZF 4184201CR5.
Materials
| Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
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