באתרו מיקרוסקופיה לקביעת בזמן אמת של מורפולוגיה תא חד בBioprocesses
Summary
צילום אופטי במכשיר מיקרוסקופ באתרו פותחה כדי לפקח על גודל של תאים בודדים ישירות בתא ההשעיה. מדידה בזמן אמת מתבצעת על ידי צימוד sterilizable הבדיקה צילום אופטי לניתוח תמונה אוטומטית. שינויים מורפולוגיים מופיעים בתלות במצב הגדילה ובתנאי הטיפוח.
Abstract
בניטור באתרו של חיידקים bioprocesses מוגבל בעיקר תכונות כימיות ופיזיות של המדיום (g., ערך ה-pH ואת ריכוז החמצן מומס). עם זאת, המבנה של התאים יכול להיות מחוון מתאים לתנאים אופטימליים, שכן הוא משתנה עם התלות במצב הגדילה, הצטברות המוצר ומתח התאים. יתרה מזאת, התפלגות הגודל בתא היחיד מספקת לא רק מידע על תנאי הטיפוח, אלא גם על הטרוגניות האוכלוסיה. כדי לקבל מידע כזה, צילום אופטי במכשיר מיקרוסקופ באתרו 1 פותחה כדי לאפשר את הניטור של התפלגות בגודל תא יחיד ישירות ההשעיה התא ב bioreactors. ניתוח תמונה אוטומטי משולב למיקרוסקופיה המבוססת על מודל רשת עצבי, אשר מאומן עם תמונות המשתמש מוערת. מספר פרמטרים, אשר השיגו מן לכידות של המיקרוסקופ, מתואמים את תהליך התכונות הרלוונטיות של התאים, כמו פעילות מטבולית שלהם. עד עכשיו, הציג את סדרת בדיקה מיקרוסקופית באתרו הוחל למדוד את גודל הגלולה בתוך שתלים פטריות filamentous. הוא שימש כדי להבדיל את הגודל תא יחיד בטיפוח מיקרואצות ולקשר אותו להצטברות השומנים. הצורה של חלקיקים סלולריים היה קשור הנצה בתרבויות שמרים. ניתוח מיקרוסקופ יכול להיות מפוצל בדרך כלל לתוך שלושה צעדים: (i) רכישת תמונה, (ii) זיהוי חלקיקים, ו (iii) ניתוח נתונים, בהתאמה. כל הצעדים צריך להיות מותאם לאורגניזם, ולכן מידע ספציפי מסומן נדרש על מנת להשיג תוצאות אמינות. היכולת לעקוב אחר שינויים במיורפולוגיה של התא ישירות בשורה או בשורה (באמצעות מעבר) מאפשרת ערכי זמן-אמת לניטור ולבקרה, בפיתוח תהליכים כמו גם בקנה מידה לייצור. אם נתוני הקו כבוי משפיעים על נתוני הזמן האמיתי, מדידות הקו המשוכבות הנוכחיות עם השפעות לא ידועות בגודל התא הופכות למיותר.
Introduction
תכונות מורפולוגיות של תאים קשורות בדרך כלל למצב הפיזיולוגי, חיבור בין הטופס לפונקציה קיים עבור יישומים רבים. המבנה של תא בודד מושפע ממצב הצמיחה, הגיל של התא, אוסמוטי ומדגיש תאים פוטנציאליים אחרים או הצטברות מוצר. שינויים מורפולוגיים של תאים הם לעתים קרובות מידה של חיוניות הצמיחה של התרבות. סינתזה המוצר התאיים, הצטברות ליפיד באצות היווצרות גוף הכללה בחיידקים, בין היתר, קשורים בגודל התא גם. הוצאת תא יכולה להיות גורם נוסף ששווה לחקור כפי שמסוכם לאחרונה2.
הטרוגניות של האוכלוסייה ניתן לכמת על בסיס תכונות מורפולוגיות של תאים בודדים. מחקרים הראו כי הטרוגניות בתוך תרבות עשויה להיות משמעותית, לדוגמה, תחת תנאי ייצור בקנה מידה גדול3 התשואה הכוללת עשויה להיות מושפעת ביצועים נמוכים של אוכלוסיות משנה4.
בדרך כלל, הערכה של תכונות מורפולוגיים של תאים מבוצעת על ידי דגימה ידנית או עם תא באמצעות מעבר זרם משולב למכשיר צילום אופטי. פעולה זו מובילה למספר הגבלות: הכמות המוגבלת של הנתונים הנרכשים בקושי יכולה לספק מדידות אמינות מבחינה סטטיסטית; עיכוב הזמן בין הדגימה לבין הנגישות של תוצאות עשוי להיות ארוך מדי בהשוואה לדינמיקה של התהליך; והחשוב ביותר, הליך הדגימה (מיקום יציאת הדגימה, טרום טיפול של המדגם לפני המדידה, תנאים שלילי בדגימה או לעקוף צינור) יכול לעורר שגיאה מוטה כמו ההליך לדוגמה עצמה יכול כבר להשפיע על התא ורפולוגיה. לבסוף, קיים תמיד סיכון גבוה לזיהום במהלך הדגימה או באמצעות העברת פתרונות, אם הם לא sterilizable במקום.
היישום של מיקרוסקופ באתרו (ISM) יכול לעקוף כמה מהבעיות הללו. אם התאים מזוהים באופן אוטומטי, ניתןלסקר אתהזיהוי הנכון של התכונות הורפולוגיות שלהם. עד היום, המגבלות העיקריות של שיטה זו היו (i) זמן ההערכה של תמונות, אשר היה ארוך מדי עבור יישומים באתרו , ו (ii) הרזולוציה הגרועה של תמונות, במיוחד בצפיפויות תאים גבוהים. למרות הפתרונות הראשונים של ISM כללו דגימה מכנית, דילול של המקדח, או היו מוגבלים על ידי-pass מערכת6,7, גישות נוספות לאפשר ללכוד את ההשעיה התא ישירות8.
ההתקדמות האחרונה ב-ISM מאפשרת את הקו או על ניטור קו של תאים על בסיס תא בודד, אשר מספק את ההתפלגות של פרמטרים מורפולוגיים בזמן אמת ישירות בתוך השעיות התא בריכוזים גבוהים במידה ניכרת של תאים. דרך ניתוח שורה של פרמטרי המפתח של התאים, היחסים עם מידע שסופקו על ידי זיהוי תא אוטומטי מצמידים ו ISM ניתן לזהות. לאחר מכן, מושגת עיצובים חדשים של חיישנים רכים, בהם פרמטר שאינו ניתן למדידה מוערך באמצעות מורפולוגיה של תא יחיד.
בדו ח זה, ISM מתנהל על ידי צימוד בדיקה צילום אופטי לניתוח תמונה אוטומטית. ISM מורכב בדיקה אחת מוט חיישן המאפשרת לכידת תמונות בתוך טווח המוקד הידוע בפער מדידה מתכווננת עם מצלמה CCD ברזולוציה גבוהה [MM-Ho = CCD GT2750 (2750×2200) ו MM 2.1 = CMOS G507c (2464×2056)]. תאורת ההבזק מתבצעת באמצעות שידור. לכן, מקורו של האור מהצד הנגדי של המצלמה9 ועוצמתו ניתן לכוונן. תאים עוברים ברציפות דרך פער זה עם הזרימה הנוזלית. לפיכך, מתקבלת אוכלוסיית דוגמה ייצוגית. הגשוש יכול להיות רכוב ישירות על ביוריאקטור כך שהוא מגיע לתוך ההשעיה התא, או שהוא יכול לשמש sterilizable by-לעבור. מעטפת חיישן מחובר למערכת לפני עיקור, חלקים אופטיים מחוברים לאחר מכן לתוך המעטפת.
, עד עכשיו מיקרואורגניזמים תעשייתיים רלוונטיים, למשל, פטריות filamentous (קוטר של עד מעל 200 μm), את הheterotrophic מיקרואצות קריפטיום cohnii (קוטר תא ממוצע של 20 μm), ואת סכביפיסים שמרים cerevisiae ס (קוטר התא הממוצע של 5 μm), נחקרו עם זה או התקנים דומים, אשר תיאר בקרוב.
פטריות filamentous נוטים ליצור כדורי בתנאי טיפוח מסוימים. אלה הם בגודל של עד כמה מאות μm. הלקורבן התאים הפטרייתיים מפתחים באורכים שונים את התלות בלחץ ההידרודינמי בשלב הנוזלים. זה יש השפעה על פעילות מטבולית וצמיחה, ספיגת המצע ושחרור המוצר. ISM הוחל על זיהוי התפלגות גודל הגלולה ואת רוחב האזורים של צפיפות ביומסה נמוכה בקצות כדורי (נתונים שלא פורסמו).
בגודל של C. cohnii משנה בין 15 ו 26 יקרומטר כאשר התאים לצבור חומצה שומן רב בלתי רווי docosahexaenoic חומצה (DHA) תחת הגבלת חנקן. תהליך הייצור הביוטכנולוגי הזה מורכב משני חלקים, שלב הצמיחה, שבו התאים להפריד ולהיות קטנים יותר, ואת שלב הייצור, שבו תאים לצבור את המוצר וכך להיות גדול יותר. לכן, גודל התא שימש כדי לקבוע את מצב התהליך, שבו הצמיחה או הייצור DHA היה חיובי. לבסוף, המתאם בין גודל התא לבין תוכן ה-DHA נמצא. במקרה זה, ISM מאפשר לפקח על הצטברות DHA תאיים בזמן אמת ללא דרישה של דגימה, שיבוש התא, ואת כרומטוגרפיה משותף ניתוח גז10.
שמרים הנצה הוא בדרך כלל בגודל בין 3 ו 8 μm. היחס בין התאים הנמצאים במצב של בגרות בכל פעם, כפי שמתואר באינדקס החיים (BI), מספק מידע על חיוניות הצמיחה11,12, ואפילו קשר עם הפרשת חלבון רקומביננטי הוכח13. עם העזרה של ISM, הנצה ושלא הנצה תאים שמרים (תאים עם ובלי ניצן) היו מכובדים14. תנאי הסטרס יכולים גם להוביל לווריאציה רחבה יותר של גודל התא בתוך אוכלוסיית שמרים, כפי שניתן לראות לאחרונה בזנים הגדלים, בהם התנאים של זנים מוגבלים בקנה מידה מוגבל של מזינים-הזנת אצווהשלושה.
לפיכך, לISM יש פוטנציאל לפקח על חיוניות הצמיחה ועל היווצרות המוצר ברמה של תא בודד במהלך כל שלבי הביורורות לזיהוי מצבי טיפוח אופטימליים, או למטרת שליטה בתהליך. השיטות המתוארות כאן מתמקדות ביישומים מיקרוביאלית עם תאים בודדים, אך חלים גם על חלקיקים גדולים יותר כמו תאים אנושיים ובעלי חיים, תא אגלוגית וכדוריות של אורגניזמים filamentous.
Protocol
Representative Results
Discussion
ISM כפי שהוצג כאן עם מכשירים זהים או דומים מאוד השתמשו כדי למדוד דינמיקה מורפולוגית של פטריות, מיקרואצות, ותאי שמרים, אשר איפשר את קביעת פעילות הצמיחה, ובמקרה של אצות, הצטברות מוצר תאיים. החיישן אינו כולל חלקים מטלטלין והוא ישים באופן ישיר בכל ביוריאקטור מעורבב סטנדרטי, או דרך נמל רגיל או steril…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה על תמיכתם של המשרד הפדרלי הגרמני לכלכלה ואנרגיה במסגרת צים-קופ, פרויקט “ביקורת תהליך חכם”, להעניק לא. ZF 4184201CR5.
Materials
| Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
Referências
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. – Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
