सीटू में बायोप्रोसेस में सिंगल-सेल मॉर्फोलॉजी के वास्तविक समय निर्धारण के लिए माइक्रोस्कोपी
Summary
सेल निलंबन में सीधे एकल कोशिकाओं के आकार की निगरानी के लिए सीटू माइक्रोस्कोपी डिवाइस में एक फोटो-ऑप्टिकल विकसित किया गया था। वास्तविक समय माप एक स्वचालित छवि विश्लेषण करने के लिए फोटो ऑप्टिकल बंध्याकरण जांच युग्मन द्वारा आयोजित किया जाता है । विकास राज्य और खेती की स्थिति पर निर्भरता के साथ रूपात्मक परिवर्तन दिखाई देते हैं।
Abstract
माइक्रोबियल बायोप्रोसेस में सीटू निगरानी में ज्यादातर माध्यम के रासायनिक और भौतिक गुणों(जैसेपीएच मूल्य और भंग ऑक्सीजन एकाग्रता) तक सीमित है। फिर भी, कोशिकाओं की आकृति विज्ञान इष्टतम स्थितियों के लिए एक उपयुक्त संकेतक हो सकता है, क्योंकि यह विकास राज्य, उत्पाद संचय और सेल तनाव पर निर्भरता के साथ बदलता है। इसके अलावा, एकल सेल आकार वितरण न केवल खेती की स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करता है, लेकिन यह भी जनसंख्या विषमता के बारे में । ऐसी जानकारी हासिल करने के लिए बायोरिएक्टरों में सेल सस्पेंशन में सीधे सिंगल सेल साइज डिस्ट्रीब्यूशन की मॉनिटरिंग कर के लिए सीटू माइक्रोस्कोपी डिवाइस1 में फोटो ऑप्टिकल तैयार किया गया था। एक स्वचालित छवि विश्लेषण एक तंत्रिका नेटवर्क मॉडल के आधार पर माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित है, जिसे उपयोगकर्ता-एनोटेटेड छवियों के साथ प्रशिक्षित किया जाता है। कई पैरामीटर, जो माइक्रोस्कोप के कैप्चर से प्राप्त होते हैं, कोशिकाओं की प्रासंगिक विशेषताओं को संसाधित करने के लिए सहसंबद्ध हैं, जैसे कि उनकी मेटाबोलिक गतिविधि। अब तक, सीटू माइक्रोस्कोपी जांच श्रृंखला में प्रस्तुत तंतु कवक निलंबन में गोली के आकार को मापने के लिए लागू किया गया था। इसका उपयोग सूक्ष्मशैवाल खेती में एकल कोशिका आकार को अलग करने और लिपिड संचय से संबंधित करने के लिए किया गया था। सेलुलर कणों का आकार खमीर संस्कृतियों में नवोदित से संबंधित था। माइक्रोस्कोपी विश्लेषण को आम तौर पर तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है: (i) छवि अधिग्रहण, (ii) कण पहचान, और (iii) डेटा विश्लेषण, क्रमशः। सभी चरणों को जीव के अनुकूल बनाना होगा, और इसलिए विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए विशिष्ट एनोटेटेड जानकारी की आवश्यकता होती है। सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता सीधे लाइन में या लाइन पर (एक बाय-पास में) प्रक्रिया विकास के साथ-साथ उत्पादन पैमाने पर निगरानी और नियंत्रण के लिए वास्तविक समय मूल्यों को सक्षम बनाती है। यदि ऑफ लाइन डेटा वास्तविक समय डेटा के साथ संबंधित है, तो सेल आकार पर अज्ञात प्रभावों के साथ वर्तमान थकाऊ ऑफ लाइन माप अनावश्यक हो जाते हैं।
Introduction
कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताएं अक्सर शारीरिक स्थिति से संबंधित होती हैं, कई अनुप्रयोगों के लिए फॉर्म और फ़ंक्शन के बीच एक संबंध मौजूद होता है। एक कोशिका की आकृति विज्ञान विकास की स्थिति, कोशिका की उम्र, ओस्मोटिक और अन्य संभावित कोशिका तनाव या उत्पाद संचय से प्रभावित होती है। कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन अक्सर संस्कृति की विकास जीवन शक्ति का एक उपाय होते हैं। इंट्रासेलर उत्पाद संश्लेषण, शैवाल में लिपिड संचय और बैक्टीरिया में शरीर के गठन को शामिल करना, दूसरों के बीच, कोशिका आकार से भी संबंधित हैं। सेल समूह एक और कारक है कि हाल ही में2संक्षेप के रूप में जांच के लायक है हो सकता है ।
व्यक्तिगत कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर जनसंख्या विषमताओं की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। अध्ययनों से पता चला है कि एक संस्कृति के भीतर विषमता महत्वपूर्ण हो सकता है, उदाहरण के लिए,बड़े पैमाने पर उत्पादन की स्थिति के तहत3 समग्र उपज उपआबादी4के कम प्रदर्शन से प्रभावित हो सकता है ।
आमतौर पर, कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं का मूल्यांकन मैनुअल नमूने द्वारा या एक बाय-पास प्रवाह कक्ष के साथ फोटो-ऑप्टिकल डिवाइस के साथ किया जाता है। यह कई प्रतिबंधों की ओर जाता है: अधिग्रहीत डेटा की सीमित मात्रा शायद ही सांख्यिकीय विश्वसनीय माप प्रदान कर सकती है; प्रक्रिया की गतिशीलता की तुलना में नमूने और परिणामों की पहुंच के बीच समय में देरी बहुत लंबी हो सकती है; और सबसे महत्वपूर्ण, नमूना प्रक्रिया (नमूना बंदरगाह का स्थान, माप से पहले नमूने का पूर्व-उपचार, नमूना या बाईपास ट्यूब में प्रतिकूल स्थितियां) एक पक्षपातपूर्ण त्रुटि को ट्रिगर कर सकती है क्योंकि नमूना प्रक्रिया पहले से ही सेल को प्रभावित कर सकती है Morphology. अंत में, वहां हमेशा नमूना या उप पास समाधान में संदूषण का एक उच्च जोखिम मौजूद है, अगर वे जगह में बंध्याकरण नहीं कर रहे हैं ।
सीटू माइक्रोस्कोपी (आईएसएम) में आवेदन इनमें से कई समस्याओं को दरकिनार कर सकता है। यदि कोशिकाओं को स्वचालित रूप से पता लगाया जाता है, तो उनकी रूपात्मक विशेषताओं की सही पहचान5का सर्वेक्षण किया जा सकता है। अब तक, इस विधि की मुख्य सीमाएं छवियों का मूल्यांकन समय (i) थीं, जो सीटू अनुप्रयोगों में बहुत लंबा था, और (ii) छवियों का खराब समाधान, विशेष रूप से उच्च सेल घनत्व पर। हालांकि आईएसएम के पहले समाधानों में यांत्रिक नमूना, जांच को कमजोर करना, या एक बाय-पास सिस्टम6,7तक सीमित था, आगे के दृष्टिकोण सीधे8सेल निलंबन को पकड़ने की अनुमति देते हैं।
आईएसएम में हाल की प्रगति एकल-कोशिका आधार पर कोशिकाओं की लाइन में या ऑन लाइन निगरानी के लिए अनुमति देती है, जो वास्तविक समय में रूपात्मक मापदंडों का वितरण सीधे सेल निलंबन में काफी उच्च सेल सांद्रता पर प्रदान करती है। कोशिकाओं के प्रमुख मापदंडों के ऑफ लाइन विश्लेषणों के माध्यम से, युग्मित स्वचालित सेल डिटेक्शन और आईएसएम द्वारा प्रदान की गई जानकारी के साथ सहसंबंधों की पहचान की जा सकती है। फिर, नए नरम सेंसर डिजाइन प्राप्त किए जाते हैं, जिसमें एकल-कोशिका आकृति विज्ञान के साथ एक अथाह पैरामीटर का अनुमान लगाया जाता है।
इस रिपोर्ट में, आईएसएम एक स्वचालित छवि विश्लेषण के लिए एक फोटो ऑप्टिकल जांच युग्मन द्वारा आयोजित किया जाता है । आईएसएम में एक एकल-रॉड सेंसर जांच होती है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीसीडी कैमरा [एमएम-हो = सीसीडी GT2750 (2750×2200) और एमएम 2.1 = CMOS G507c (2464×2056)) के साथ एक समायोज्य माप अंतर में एक ज्ञात फोकस रेंज के भीतर छवियों को कैप्चर करने में सक्षम बनाता है। फ्लैश लाइट रोशनी ट्रांसमिशन द्वारा आयोजित की जाती है। इसलिए, प्रकाश कैमरा9 के विपरीत दिशा से निकलती है और इसकी तीव्रता को समायोजित किया जा सकता है। कोशिकाएं तरल प्रवाह के साथ इस अंतर से लगातार गुजरती हैं। इसलिए, एक प्रतिनिधि नमूना आबादी प्राप्त की जाती है। जांच सीधे बायोरिएक्टर में लगाई जा सकती है ताकि यह सेल निलंबन में पहुंच सके, या फिर इसका उपयोग एक बंध्याकरण ीय पास में किया जा सके। सेंसर शेल नसबंदी से पहले सिस्टम से जुड़ा हुआ है, ऑप्टिकल पार्ट्स बाद में खोल में घुड़सवार हैं ।
अब तक, प्रासंगिक औद्योगिक सूक्ष्मजीवों, जैसे,फिलामेंटलस कवक (200 माइक्रोन से अधिक का व्यास), हेट्रोट्रोफिक माइक्रोएल्गा क्रापथेकोडिनियम कोहनी (20 माइक्रोन का औसत कोशिका व्यास), और खमीर सैचारोमाइसेस सेरेविसी (5 माइक्रोन का औसत कोशिका व्यास), इस या इसी तरह के उपकरणों के साथ जांच की गई थी, जिसे शीघ्र ही वर्णित किया गया है।
फिलामेंतुस कवक कुछ खेती की स्थितियों के तहत छर्रों का निर्माण करते हैं। ये कई सौ μm तक के आकार के होते हैं। कवक कोशिकाओं का हाइफे तरल पदार्थ चरण में हाइड्रोडायनामिक तनाव पर निर्भरता में विभिन्न लंबाई विकसित करता है। यह मेटाबोलिक और विकास गतिविधि, सब्सट्रेट तेज और उत्पाद रिलीज पर प्रभाव डालता है। आईएसएम को पैलेट आकार वितरण और छर्रों के किनारों पर कम बायोमास घनत्व के क्षेत्रों की चौड़ाई (स्वयं के अप्रकाशित डेटा) की पहचान करने के लिए लागू किया गया था।
सी कोहनी का आकार 15 से 26 माइक्रोन के बीच बदल जाता है जब कोशिकाएं नाइट्रोजन सीमा के तहत पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड डोकोसाहेक्सोइक एसिड (डीएचए) जमा करती हैं। इस जैव प्रौद्योगिकीय डीएचए उत्पादन प्रक्रिया में दो भाग होते हैं, विकास चरण, जिसमें कोशिकाएं विभाजित होती हैं और छोटी हो जाती हैं, और उत्पादन चरण, जिसमें कोशिकाएं उत्पाद को जमा करती हैं और इस प्रकार बड़ी हो जाती हैं। इसलिए, कोशिका आकार का उपयोग प्रक्रिया राज्य निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसमें या तो विकास या डीएचए उत्पादन अनुकूल था। अंत में, सेल आकार और डीएचए सामग्री के बीच एक संबंध पाया गया। इस मामले में, आईएसएम नमूने, सेल व्यवधान और सामान्य गैस क्रोमेटोग्राफी विश्लेषण10की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में इंट्रासेलुलर डीएचए संचय की निगरानी करने की अनुमति देता है।
नवोदित खमीर आमतौर पर 3 और 8 माइक्रोन के बीच आकार का होता है। एक समय में परिपक्वता स्थिति में कोशिकाओं का अनुपात, जैसा कि नवोदित सूचकांक (बीआई) के साथ वर्णित है, विकास जीवन शक्ति11,12के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और यहां तक कि पुनः संयोजन प्रोटीन स्राव के साथ एक संबंधभी 13साबित किया गया है। आईएसएम की मदद से नवोदित और गैर-नवोदित खमीर कोशिकाएं (कली के साथ और बिना कोशिकाएं)14प्रतिष्ठित थीं। तनाव की स्थिति भी खमीर आबादी के भीतर सेल आकार की एक व्यापक भिन्नता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जैसा कि हाल ही में पैमाने पर खेती में दिखाया गया है, जिसमें बड़े पैमाने पर पोषक तत्वों की स्थिति सीमित फेड बैच की खेती की नकल3थे ।
इसलिए, आईएसएम में इष्टतम खेती की स्थिति की पहचान के लिए जैव प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान या प्रक्रिया नियंत्रण के उद्देश्य के लिए एकल-कोशिका स्तर पर विकास जीवन शक्ति और उत्पाद गठन की निगरानी करने की क्षमता है। यहां वर्णित विधियां एकल कोशिकाओं के साथ माइक्रोबियल अनुप्रयोगों पर केंद्रित हैं, लेकिन मानव और पशु कोशिकाओं, कोशिका समूहऔर तंतु जीवों के छर्रों जैसे बड़े कणों पर भी लागू होती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईएसएम का उपयोग कवक, सूक्ष्मशैवाल और खमीर कोशिकाओं की रूपात्मक गतिशीलता को मापने के लिए किया गया था, जिसने विकास गतिविधि के निर्धारण को सक्षम किया, और शैवाल, इंट्रासेलर उत्पाद संचय के मामले में। सेंसर ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक जर्मन संघीय अर्थशास्त्र और ऊर्जा मंत्रालय के समर्थन के लिए आभारी हैं ढांचे ZIM-Koop, परियोजना “स्मार्ट प्रक्रिया निरीक्षण”, अनुदान नहीं । जेडएफ 4184201CR5.
Materials
| Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
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