In Situ Microscopia per la determinazione in tempo reale della morfologia a singola cellula nei bioprocessi

Summary

È stato sviluppato un dispositivo di microscopia foto-ottica in situ per monitorare le dimensioni delle singole cellule direttamente nella sospensione cellulare. La misurazione in tempo reale viene effettuata accolando la sonda sterilizzabile fotoottica a un’analisi automatizzata delle immagini. I cambiamenti morfologici compaiono con dipendenza dallo stato di crescita e dalle condizioni di coltivazione.

Abstract

Il monitoraggio in situ nei bioprocessi microbici è per lo più limitato alle proprietà chimiche e fisiche del mezzo(ad esempio,il valore di pH e la concentrazione di ossigeno disciolto). Tuttavia, la morfologia delle cellule può essere un indicatore adatto per condizioni ottimali, poiché cambia con la dipendenza dallo stato di crescita, l’accumulo di prodotto e lo stress cellulare. Inoltre, la distribuzione delle dimensioni delle singole cellule fornisce non solo informazioni sulle condizioni di coltivazione, ma anche sull’eterogeneità della popolazione. Per ottenere tali informazioni, è stato sviluppato un dispositivo di microscopia in situ foto-ottico¹ per consentire il monitoraggio della distribuzione delle dimensioni delle singole cellule direttamente nelle sospensioni cellulari nei bioreattori. Un’analisi automatizzata delle immagini viene accoppiata alla microscopia basata su un modello di rete neurale, sottoposto a training con immagini con annotato dall’utente. Diversi parametri, che si ottengono dalle catture del microscopio, sono correlati per elaborare le caratteristiche rilevanti delle cellule, come la loro attività metabolica. Fino ad ora, la serie di sonde di microscopia in situ è stata applicata per misurare la dimensione del pellet nelle sospensioni filamentose dei funghi. È stato utilizzato per distinguere le dimensioni delle singole cellule nella coltivazione delle microalghe e metterle in relazione con l’accumulo di lipidi. La forma delle particelle cellulari era correlata al germogliamento nelle colture di lievito. L’analisi della microscopia può essere generalmente suddivisa in tre fasi: (i) acquisizione di immagini, (ii) identificazione delle particelle e (iii) analisi dei dati, rispettivamente. Tutte le misure devono essere adattate all’organismo, e quindi sono necessarie informazioni specifiche con annotato per ottenere risultati affidabili. La capacità di monitorare i cambiamenti nella morfologia cellulare direttamente in linea o on line (in un by-pass) consente valori in tempo reale per il monitoraggio e il controllo, nello sviluppo dei processi e nella scala di produzione. Se i dati off line sono correlati ai dati in tempo reale, le misurazioni off line correnti con influenze sconosciute sulla dimensione della cellula diventano inutili.

Introduction

Le caratteristiche morfologiche delle cellule sono spesso legate allo stato fisiologico, esiste una connessione tra forma e funzione per molte applicazioni. La morfologia di una singola cellula è influenzata dallo stato di crescita, dall’età della cellula, dalle sollecitazioni osmotiche e da altre potenziali sollecitazioni cellulari o dall’accumulo di prodotti. I cambiamenti morfologici delle cellule sono spesso una misura della vitalità di crescita di una cultura. Sintesi del prodotto intracellulare, accumulo di lipidi nelle alghe e formazione del corpo di inclusione nei batteri, tra gli altri, sono correlati con la dimensione della cellula pure. L’agglomerazione cellulare può essere un altro fattore che vale la pena indagare come riassunto di recente².

Le eterogeneità della popolazione possono essere quantificate sulla base delle caratteristiche morfologiche delle singole cellule. Gli studi hanno dimostrato che l’eterogeneità all’interno di una cultura potrebbe essere significativa, ad esempio, in condizioni di produzione su larga scala³ la resa complessiva potrebbe essere influenzata da una bassa performance delle sottopopolazioni⁴.

Di solito, la valutazione delle caratteristiche morfologiche delle cellule viene eseguita mediante campionamento manuale o con una camera di flusso by-pass accoppiata a un dispositivo foto-ottico. Questo porta a diverse restrizioni: la quantità limitata di dati acquisiti difficilmente può fornire misurazioni statisticamente affidabili; il ritardo tra il campionamento e l’accessibilità dei risultati può essere troppo lungo rispetto alle dinamiche del processo; e, cosa più importante, la procedura di campionamento (posizione della porta di campionamento, pretrattamento del campione prima della misurazione, condizioni sfavorevoli nel tubo di campionamento o bypass) può innescare un errore di parte in quanto la procedura di campionamento stessa può già influenzare la cellula Morfologia. Infine, esiste sempre un alto rischio di contaminazione durante il campionamento o nelle soluzioni by-pass, se non sono sterilizzabili in posizione.

L’applicazione della microscopia in situ (ISM) può aggirare molti di questi problemi. Se le cellule vengono rilevate automaticamente, è possibile esaminare una corretta identificazione delle loro caratteristiche morfologiche⁵. Fino ad ora, i principali limiti di questo metodo erano (i) il tempo di valutazione delle immagini, che era troppo lungo per le applicazioni in situ, e (ii) la scarsa risoluzione delle immagini, soprattutto ad alta densità di cellule. Sebbene le prime soluzioni di ISM includessero il campionamento meccanico, la diluizione della sonda o fossero limitate a un sistema by-pass^6,7, ulteriori approcci consentono l’acquisizione direttamente della sospensione cellulare⁸.

I recenti progressi nell’ISM consentono il monitoraggio in linea o on line delle cellule su base a singola cellula, che fornisce la distribuzione dei parametri morfologici in tempo reale direttamente nelle sospensioni cellulari a concentrazioni cellulari notevolmente elevate. Attraverso analisi off-line dei parametri chiave delle cellule, è possibile identificare le correlazioni con le informazioni fornite dal rilevamento automatico delle cellule accoppiato e dall’ISM. Quindi, vengono ottenuti nuovi progetti di sensori morbidi, in cui un parametro non misurabile viene stimato con la morfologia a cella singola.

In questo rapporto, l’ISM è condotto acunmando una sonda foto-ottica a un’analisi automatizzata delle immagini. L’ISM è costituito da una sonda sensore a singola asta che consente l’acquisizione di immagini all’interno di un intervallo di messa a fuoco noto in un gap di misura regolabile con una telecamera CCD ad alta risoluzione [MM-Ho – CCD GT2750 (2750×2200) e MM 2.1 – CMOS G507c (2464×2056)]. L’illuminazione della luce flash avviene tramite trasmissione. Pertanto, la luce proviene dal lato opposto della fotocamera⁹ e la sua intensità può essere regolata. Le cellule passano continuamente attraverso questo divario con il flusso di liquido. Di conseguenza, si ottiene una popolazione campione rappresentativa. La sonda può essere montata direttamente al bioreattore in modo che raggiunga la sospensione cellulare, oppure può essere utilizzata in un by-pass sterilizzabile. Il guscio del sensore è collegato al sistema prima della sterilizzazione, le parti ottiche vengono successivamente montate nel guscio.

Fino ad ora, i microrganismi industriali rilevanti, ad esempioi funghi filamentosi (diametro fino a oltre 200 m), le microalghe eterotrofiche Criptodinium cohnii (diametro medio delle cellule di 20 m), e il lievito Saccharomyces cerevisiae (diametro medio delle cellule di 5 m), sono stati studiati con questo o dispositivi simili, che è brevemente descritto.

I funghi filamentosi tendono a formare pellet in determinate condizioni di coltivazione. Questi sono di una dimensione di diverse centinaia di m. Le ife delle cellule fungine sviluppano diverse lunghezze di dipendenza dallo stress idrodinamico nella fase fluida. Questo ha un’influenza sull’attività metabolica e di crescita, l’assorbimento del substrato e il rilascio del prodotto. ISM è stato applicato per identificare la distribuzione delle dimensioni del pellet e la larghezza delle zone di minore densità di biomassa ai bordi dei pellet (dati inediti).

La dimensione di C. cohnii cambia tra 15 e 26 m quando le cellule accumulano l’acido grasso polinsaturico docosaexaenoico acido (DHA) sotto limiti di azoto. Questo processo di produzione di DHA biotecnologico è costituito da due parti, la fase di crescita, in cui le cellule si dividono e diventano più piccole, e la fase di produzione, in cui le cellule accumulano il prodotto e quindi diventano più grandi. Pertanto, la dimensione della cella è stata utilizzata per determinare lo stato del processo, in cui la crescita o la produzione di DHA era favorevole. Infine, è stata trovata una correlazione tra la dimensione della cella e il contenuto DHA. In questo caso, ISM permette di monitorare l’accumulo di DHA intracellulare in tempo reale senza il requisito di campionamento, interruzione delle cellule, e l’analisi cromatografia gas comune¹⁰.

Il lievito di busparazione è di solito di dimensioni comprese tra 3 e 8 m. La percentuale di cellule che sono nello stato di maturazione alla volta, come descritto con l’indice in erba (BI), fornisce informazioni sulla vitalità della crescita^11,12, e anche una relazione con la secrezione proteica ricombinante è stata dimostrata¹³. Con l’aiuto di ISM, le cellule di lievito in erba e non in erba (cellule con e senza gemme) si sono distinte¹⁴. Le condizioni di stress possono anche portare a una variazione più ampia delle dimensioni delle cellule all’interno di una popolazione di lieviti, come recentemente mostrato nelle coltivazioni scale-down, in cui le condizioni di coltivazioni alimentate con limitato nutrimento su larga scala sono state imitate³.

Pertanto, ISM ha il potenziale per monitorare la vitalità della crescita e la formazione del prodotto a livello di singola cellula durante tutte le fasi di un bioprocesso per l’identificazione di condizioni di coltivazione ottimali o ai fini del controllo dei processi. I metodi qui descritti si concentrano sulle applicazioni microbiche con singole cellule, ma sono applicabili anche a particelle più grandi come cellule umane e animali, agglomerati cellulari e pellet di organismi mentosi.

Protocol

NOTA: I seguenti passaggi sono necessari per adattare i parametri alle rispettive condizioni di microrganismo e coltura. La regolazione delle impostazioni della sonda dura circa 20 min per un utente esperto. Una descrizione dettagliata degli strumenti e dei passaggi è fornita nel manuale della sonda corrispondente di SOPAT GmbH. In generale, gli strumenti che sono presentati nel seguente protocollo sono necessari: (i) Probe Controller per le regolazioni probe e l’acquisizione dell’immagine; (ii) Figi (Image…

Representative Results

Il rilevamento delle dimensioni delle cellule nelle colture di lievito con l’ISM e il rilevamento automatico delle immagini per distinguere tra cellule in erba e non in erba è stato condotto con successo. Sia l’intensità dello stroboscopio che la scelta del divario di misurazione hanno una gamma di tolleranza, in cui l’identificazione delle particelle non è influenzata. Ad esempio, le cellule di S. cerevisiae sono state misurate con varie intensità dello stroboscopio all’inte…

Discussion

ISM come presentato qui con lo stesso o molto simili dispositivi è stato utilizzato per misurare la dinamica morfologica di funghi, microalghe e lieviti, che ha permesso la determinazione dell’attività di crescita, e in caso di alghe, l’accumulo di prodotti intracellulari. Il sensore non ha parti mobili ed è direttamente applicabile in qualsiasi bioreattore di serbatoio agitato standard, sia attraverso una porta standard o in un by-pass sterilizzabile. Poiché il lievito è molto più piccolo delle alghe, la riduzione…

Materials

Sensor MM 2.1 – MFC	SOPAT GmbH, Germany	n.a.	Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell
Sofware version v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Germany	n.a.
Thickness gauge	n.n.		It can be any supplier, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70%	n.n.		It can be any supplier
SOPAT manual Version 2.0.5	SOPAT GmbH, Germany
Optical lense paper	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	open source
50 mL conical centrifuge tubes			It can be any supplier