הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד
Summary
שיטה שאינה שכותרתו, הלא-רדיו-איזוטרופי DNA פולימראז הגהה ואת וזמינותו תיקון של ה-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF ברזולוציה גבוהה ואסטרטגיה סיומת נוקלאוטיד יחיד. וזמינותו הוכיחה להיות מאוד ספציפי, פשוט, מהיר וקל לבצע הגהה ותיקון טלאים קצר מ 9-נוקלאוטידים.
Abstract
שמירה על הגנום ושכפול הנאמן שלה הוא בעל חשיבות עליונה לשימור מידע גנטי. כדי להעריך שכפול דיוק גבוה, פיתחנו פשוטה שאינה שכותרתו, השיטה הלא-רדיו-איזוטרופי באמצעות יינון desorption של מטריצה בסיוע לייזר עם הזמן-של-טיסה (MALDI-TOF) מסה ספקטרומטר (MS) ניתוח של מחקר ההגהה. כאן, על ה-DNA פולימראז [למשל, הרסיס Klenow (KF) של Escherichia coli DNA פולימראז אני (pol אני) במחקר זה] בנוכחות כל ארבע dideoxyribonucleotide triphosphates משמש לעיבוד דופלקס פריימר תואמים-תבנית. פריימר לא תואמת זה ואז הגהה/מורחב, נתון MALDI-TOF MS. המוצרים נבדלים על ידי השינוי המונית של ומהצמיגים עד וריאציות נוקלאוטיד יחיד. חשוב, הגהה גם ניתן לקבוע לאי-התאמות רווקה פנימי, אף על פי-יעילות שונות. אי-התאמות ממוקם ב 2-4-נוקלאוטידים (nt) מקצה 3′ היו ביעילות בצע הגהה על-ידי pol, והראה אי-התאמה בחמש nt שהמסוף פריימר תיקון חלקי בלבד. הגהה לא אירעה לאי-התאמות פנימי הממוקם ב 6-9 nt מסוף 3′ פריימר. בשיטה זו ניתן גם ליישם מבחני תיקון ה-DNA (למשל, הערכת תיקון בסיס-הנגע של סובסטרטים עבור מסלול תיקון אנדו V). תחל המכיל 3′ deoxyinosine הלפני אחרון (dI) נגעים יכול יתוקן על ידי pol אני. אכן, T הלפני אחרון-אני, G-שאני, א-אני סובסטרטים היה האחרון שלהם נוקלאוטידים המכילות dI 2 טוחנות ידי pol אני לפני הוספת של ddN נכונה 5′-monophosphate (ddNMP) תוך C הלפני אחרון-אני אי-התאמות היו נסבל על ידי pol אני, המאפשר את המפתח להאריך ללא תיקון, הממחיש הרגישות ואת הרזולוציה של MS assay כדי למדוד את תיקון ה-DNA.
Introduction
הפונקציות ההגהה של ה-DNA polymerases במהלך שכפול ה-DNA חיוניים על מנת להבטיח את אמינות גבוהה של מידע גנטי שצריך להעביר רומא1,2,3,4, 5,6,7. היכולת להעריך את תרומתם של פולימראז הגהה exonucleases להבהיר את מנגנוני שמירה על יציבות גנטית.
תיוג radioisotope, מבוסס על ג’ל מבחני בשילוב עם ניתוח densitometric של autoradiograms או זרחן-9,8,-דימות-10 באופן מסורתי שימש כדי לזהות פעילות ההגהה של דנ א polymerases. בעוד פונקציונליים, מבחני אלה הם מפרך, יקר, לא נוטה תבניות תפוקה גבוהה. בנוסף, רדיואיזוטופים סובלים סוגיות בטיחות כולל לסילוק פסולת. לחלופין, יש פעילויות ההגהה נותחו על ידי טכניקות fluorometric. לדוגמה, 2-aminopurine (2-AP) ניתן לשלב מוצרים להרחבת במהלך במבחנה פולימראז הגהה מבחני לייצר אות ניאון11,12. למרבה הצער, גישות אלה סובלים ירידה לפרטים נמוך, מאז 2-AP ניתן לשייך עם תימין וגם ציטוזין. גישות עדכניות יותר כוללים מכשיר רגיש G-quadruplex מבוססי זורח מתג-על בדיקה עבור פולימראז 3′ – 5′ אקסונוקלאז assay13 , כמו גם בדיקה פלורסנט שכותרתו ביחידים עבור פולימראז הגהה assay מתגבר על חלק החסרונות הנ ל14. להתלהבות שיטות fluorometric אלה פוחתת עקב הצורך תיוג ספציפית של ה-DNA סובסטרטים.
לעומת זאת, MS MALDI-TOF עבור ניתוח הדנ א ננקטה וזמינותו לאתר במדויק, שבו התגובות הארכת תחל עם תווית ddNTPs 4 יכול לשמש כדי לזהות פולימורפיזמים בגיל16,15,לוקוס נתון17 ו אומצה באופן נרחב ביישומים רפואיים עבור גילויים מוטציה, סרטן המאבחן18. באמצעות עקרונות בסיסיים אלה, יצרנו assay ללא תווית מצפני במבחנה DNA פולימראז הגהה פעילות מנצלים ברזולוציה גבוהה, ירידה לפרטים גבוה, ופוטנציאל תפוקה גבוהה של גב’ MALDI-תוף שימוש אי קולי DNA פולימראז אני Klenow קטע כמו אנזים מודל, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) כפי סובסטרטים יכולים לקחת את “snapshot” של הגהה מוצרים לאחר נוקלאוטיד יחיד סיומת ויה MALDI-TOF MS (איור 1).
באופן דומה, שיטה זו גם פותחה עבור assay תיקון ה-DNA איפה תחל המכיל 3′ dI הלפני אחרון נגעים ותוחלת של פול פוט שאתקן assay intermediates תיקון V עצור אשר מחקה אנדו. אמנם לא לגמרי מובן, מסלול תיקון אנדו V הוא מערכת תיקון היחיד הידוע להעסיק את פול פוט אני הגהה אקסונוקלאז פעילות הנגע כריתה19,20. באמצעות MALDI-TOF MS, נראה טלאי תיקון מוגדרים בבירור איפה אפשר להוציא dI ידי pol אני מתי המתרחשים את ה 2 האחרונים nt של פריימר לפני הוספת נוקלאוטיד המלווים את הנכון.
לצורך המחקר הגהה ותיקון דנ א, שיטה זו מייגעת פחות מאשר שיטות קודמות ומהירה והיא מספקת מידע נוסף לכיוון מנגנון ותפקוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר המתואר וזמינותו שלב אחר שלב פעילות ההגהה נותחו על ידי הכלי המסחרי הנבחר (ראה את הטבלה של חומרים) באמצעות MS MALDI-TOF. היתרונות הגדולים כוללים פריימר ואת תבנית הם תווית חינם וקל לביצוע, המאפשרות גמישות רבה יותר בתכנון ניסויים. זרם-לימון שלם עיבוד של 30 הגהה בדיקות ייקח 4h, כולל 3 h לבי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המתקן ליבה NCFPB משולב גנומיקה תפקודית (טאיפיי, טייוואן), המעבדה Pharmacogenomics NRPB (טאיפיי, טייוואן) לתמיכה טכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר קרן בריאות טייוואן (L-אינטרלוקין) ואת משרד המדע הטכנולוגיה, ROC, טאיוואן, [ביותר 105-2320-B-002-047] עבור ווי-יאו הו, [ביותר 105-2628-B-002-051-MY3] קאנג-יי סו [ MOST-105-2320-B-002-051-MY3] בליאנג לין.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Referências
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. . DNA replication. , (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Bioquímica. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3′-5′ proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3′ penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
