Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM), el cáncer cerebral primario más frecuente y agresiva en los adultos, se asocia generalmente a un pronóstico pobre, y escasas terapias eficaces se han propuesto en la última década. Entre los candidatos prometedores para el diseño de estrategias terapéuticas novedosas, han sido objeto de inmunoterapias celulares para eliminar altamente invasiva y radiorresistente quimioterapia las células del tumor, probablemente involucrados en una recaída rápida y fatal de este cáncer. Así, administraciones de allogeneic efectores GBM-reactivo de células inmunitarias, como humanos Vϒ9Vδ2 los linfocitos T, en las proximidades del tumor representa una oportunidad única para ofrecer eficiente y altamente concentrado de agentes terapéuticos directamente en el sitio de tumores malignos de cerebro. Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto preclínica para la viabilidad y la eficacia antitumoral de estas inmunoterapias celulares que dependen de inyecciones de stereotactic de linfocitos alogénicos humanos en camas de tumor intrabrain.
Introduction
GBM (que grado astrocitoma IV), es el más frecuente y agresivo cáncer cerebral primario en adultos. A pesar de tratamientos agresivos que combinan cirugía y radio-quimioterapia, GBM permanece asociado con un pronóstico extremadamente pobre (supervivencia media de 14,6 meses y una mortalidad de 2 años > 73%)1. Esto pone en evidencia que algunos avances terapéuticos eficientes han sido validados en la última década2. Entre los candidatos para el diseño de estrategias terapéuticas más eficaces3,de4,5, inmunoterapias6 se exploran actualmente para rastrear y eliminar altamente invasivo y radio/quimioterapia-resistente del tumor células, sospechadas por su contribución clave a la rápida y fatal tumor recidiva7. Varios potenciales dianas inmunológicas fueron identificadas y propuestas para inmunoterapias, participación natural o αβ modificado o linfocitos de T ϒδ como GBM-antígenos específicos de tumor o moléculas inducidas por el estrés8,9, 10. La posibilidad de administrar efectores de células inmunitarias GBM-reactivo seleccionados representa una oportunidad única para entregar cantidades elevadas de linfocitos effector directamente en el sitio de la neoplasia residual. Para apoyar esta estrategia, hemos demostrado recientemente que los modelos basados en ratones inmunodeficientes con xenoinjertos GBM humanos primarios orthotopic fielmente recapitulan el desarrollo de tumores cerebrales en GBM pacientes9,11. Por otra parte, estos modelos fueron utilizados para demostrar la fuerte eficacia antitumoral de eventualmente transferidos linfocitos allogeneic de Vϒ9Vδ2T humanos.
Este protocolo describe los pasos experimentales críticos para el logro de las inmunoterapias estereotáxicas de tumores cerebrales, como el GBM, basado en la transferencia adoptiva de linfocitos T trasplante allogeneic. Se muestra en el artículo: (i) la amplificación de linfocitos efector inmune alogénico terapéutico T, como los linfocitos Vϒ9Vδ2T humanos; (ii) la preparación de estos linfocitos efectores T para inyección; (iii) el procedimiento para la administración estereotáxica en el cerebro, cerca del tumor. Este artículo también proporciona la penetración en el comportamiento de estos efectores celulares después de la inyección estereotáctica.
El enfoque terapéutico presentado aquí se basa en la inyección de 20 x 106 efectoras células por dosis para cada ratón inmunodeficiente de con tumores de cerebro. Un paso inicial en vitro expansión es necesaria para producir grandes cantidades de células inmunitarias. Por lo tanto, no específica de la célula expansiones se realizan con fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiado células allogeneic alimentador: células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donantes sanos y de células linfoblastoides de B transformada Epstein Barr Virus EBV líneas (BLCLs), derivadas de PBMCs en vitro infección con EBV contiene cultivo sobrenadante de la línea celular de Tití B95-8, en presencia de 1 μg/mL de ciclosporina-A.
Las células inmunes efectoras GBM-reactivo se comparan y seleccionadas en vitro ensayos9. Estas células efectoras se activan y amplificaron utilizando protocolos estándar, según su naturaleza (por ejemplo, humano de los linfocitos T Vγ9Vδ29 o virus humano del herpes αβ T linfocitos12) con una pureza mínima de > 80%, como habitualmente comprobado por análisis cytometric. El procedimiento de expansión celular detallado a continuación se aplica a varios subconjuntos de linfocitos humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una transferencia adoptiva de seleccionado nativa o las células efectoras inmunes ingeniería representa un enfoque prometedor para tratar eficazmente los tumores, como los cánceres de cerebro infiltrativa, teniendo cuidado de limitar reactividades contra las células no transformadas15, 16,17,18. Sin embargo, el sistema nervioso central, que comprende el cerebro, tiene un particular estado …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al personal del Hospital de la Universidad animal (UTE) de Nantes para la cría de animales y cuidado, celular y tisular de instalaciones centrales de la Universidad de Nantes (MicroPICell) de la proyección de imagen para la proyección de imagen y la citometría (Cytocell) de Nantes por su asistencia técnica experta. Este trabajo fue financiado por el INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le cáncer (AO 2017 InterRegional) y el consorcio europeo ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). El equipo está financiado por la Fundación pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Este trabajo fue realizado en el contexto de la empresa LabEX IGO y los programas de IHU-Cesti, apoyado por la nacional investigación Agencia Investissements Avenir a través de los programas de ANR-11-LABX-0016-01 y ANR-10-IBHU-005, respectivamente. El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Metropole y la región de Pays de la Loire. Los autores agradecen Chirine Rafia para proporcionar ayuda en la corrección del manuscrito.
Materials
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
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