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Cancer Research

Phosphopeptide संवर्धन लेबल के साथ युग्मित मुक्त मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोस्टेट कैंसर में Phosphoproteome की जांच करने के लिए

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57996
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 5, 1,2,3,6,7
1Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, School of Graduate Studies, Rutgers University, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Quantitative Biomedicine, School of Graduate Studies, Rutgers University, The State University of New Jersey, 3Department of Medicine, Division of Medical Oncology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4Crump Institute for Molecular Imaging, Department of Molecular and Medical Pharmacology, Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA Metabolomics Center, and California NanoSystems Institute, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California, 6Pharmacology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 7Cancer Metabolism and Growth Program, Rutgers Cancer Institute of New Jersey
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रक्रिया को निकालने के लिए और प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइनों या ऊतकों से phosphopeptides को समृद्ध phosphoproteome के माध्यम से मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटियोमिक् के विश्लेषण के लिए ।

Abstract

Phosphoproteomics phosphorylated प्रोटीन के बड़े पैमाने पर अध्ययन शामिल है । प्रोटीन फास्फारिलीकरण कई संकेत transduction रास्ते में एक महत्वपूर्ण कदम है और कसकर kinases और phosphatases द्वारा विनियमित है । इसलिए, निस्र्पक phosphoproteome उपंयास लक्ष्यों और oncologic चिकित्सा के लिए मार्क्स की पहचान करने में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । मास स्पेक्ट्रोमेट्री दुनिया भर में पता लगाने और अद्वितीय फास्फारिलीकरण घटनाओं के हजारों यों तो एक रास्ता प्रदान करता है । हालांकि, phosphopeptides गैर phosphopeptides की तुलना में बहुत कम प्रचुर मात्रा में हैं, जैव रासायनिक विश्लेषण अधिक चुनौतीपूर्ण बना । इस सीमा को दूर करने के लिए, phosphopeptides जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करने से पहले समृद्ध करने के लिए तरीकों की आवश्यकता है । हम एक प्रक्रिया का वर्णन निकालने और प्रोटीन को पचाने के लिए ऊतक से पेप्टाइड्स उपज, phosphotyrosine के लिए एक संवर्धन द्वारा पीछा किया (pY) और phosphoserine/threonine (pST) पेप्टाइड्स एक एंटीबॉडी-आधारित और/या टाइटेनियम डाइऑक्साइड (TiO2)-आधारित संवर्धन विधि । नमूना तैयारी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद, हम बाद में तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके phosphopeptides की पहचान और मात्राएं करते हैं ।

Introduction

एक अनुमान के अनुसार १६५,००० नए मामलों और लगभग २९,००० मौतें प्रोस्टेट कैंसर के कारण २०१८ में हो जाएगा, सबसे आम कैंसर का प्रतिनिधित्व करने और संयुक्त राज्य अमेरिका में पुरुषों में कैंसर से संबंधित मौत के दूसरे प्रमुख कारण1। प्रोस्टेट कैंसर की प्रारंभिक अवस्था में अंग-सीमित रोग के लकीर या विकिरण चिकित्सा के साथ इलाज कर रहे हैं, जहां दस साल पुनरावृत्ति दर के बीच 20% और ४०% रोगियों जो prostatectomy से गुजरना के लिए और के बीच है 30% और ५०% जो विकिरण प्राप्त रोगियों के लिए थेरेपी2. क्योंकि प्रोस्टेट कैंसर के विकास के लिए संकेत एण्ड्रोजन पर निर्भर करता है, शल्य चिकित्सा और रासायनिक बधिया चिकित्सा भी उच्च जोखिम वाले रोगियों के लिए कार्यरत हैं । हालांकि, पतन तब होता है जब कैंसर अब एण्ड्रोजन अभाव चिकित्सा के रूप में जैव रासायनिक पुनरावृत्ति, जहां प्रोस्टेट-विशिष्ट प्रतिजन में सीरम उगता फिर से सबूत के रूप में प्रतिक्रिया करता है । प्रगति में इस बिंदु पर, मेटास्टेसिस अक्सर के रूप में अच्छी तरह से पता चला रहे हैं । इस उंनत चरण, मेटास्टेटिक बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर कहा जाता है, रोग के घातक रूप जहां पूर्वानुमान कम से दो साल3की एक औसत अस्तित्व समय है का प्रतिनिधित्व करता है । कुछ इलाज के विकल्प देर से चरण रोग में उपलब्ध हैं, जैसे enzalutamide और abiraterone के रूप में दूसरी पीढ़ी के antiandrogens, साथ ही साथ taxane आधारित कीमोथेरेपी docetaxel की तरह । उपलब्ध उपचार के बावजूद, रोग अक्सर प्रगति । इसलिए, खोज और उपंयास उपचार रूपरेखा के विकास के लिए उंनत रोग के साथ प्रोस्टेट कैंसर रोगियों की देखभाल में सुधार आवश्यक हैं ।

मास-स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) आधारित दृष्टिकोण proteome के एक वैश्विक विश्लेषण के माध्यम से सैकड़ों की खोज के माध्यम से उपलब्ध कराने के हजारों पेप्टाइड analytes4. विशेष रूप से, डिस्कवरी प्रोटियोमिक्, जिसे डेटा-निर्भर अर्जन (डीडीए) भी कहा जाता है,4,5के हजारों पेप्टाइड्स की पहचान और quantitation की प्राप्ति कर सकता है । एमएस-आधारित डिस्कवरी प्रोटियोमिक् आगे ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक्, जहां बरकरार प्रोटीन की विशेषता है में delineated जा सकता है, और नीचे (भी शॉटगन के रूप में जाना) प्रोटियोमिक्, जहां पेप्टाइड्स5प्रोटीन की विशेषताएं विश्लेषण कर रहे हैं । इस प्रकार, बन्दूक प्रोटियोमिक् में, एक प्रोटियोलिसिस कदम नमूना तैयार करने में एमएस विश्लेषण पूर्ववर्ती पेप्टाइड्स में प्रोटीन सट करने के लिए जगह लेता है । अंत में, एक डेटाबेस खोज पेप्टाइड्स पहचान के लिए प्रोटीन के लिए वापस मैप करने के लिए किया जाता है । लेबल-मुक्त और साथ ही कई आइसोटोप-लेबलिंग [जैसे, स्थिर आइसोटोप सेल संस्कृति (SILAC) में एमिनो एसिड द्वारा लेबलिंग] तरीकों मात्रा के लिए नमूने6,7के बीच पेप्टाइड की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि आइसोटोप लेबलिंग तकनीक सोने के मानक हैं, लेबल मुक्त तरीकों समान ठहराव accuracies8,9 का प्रदर्शन किया है और संवेदनशीलता और विशिष्टता10के बीच तुलनीय tradeoffs है. लेबल-मुक्त quantitation अधिक से अधिक कवरेज प्रदान करता है और कई नमूनों के बीच तुलना की अनुमति देता है, जबकि लेबल आधारित पद्धतियां लागत और division क्षमता6,7,8तक सीमित होती हैं ।

इसके अलावा, शॉटगन एमएस भी इस तरह के फास्फारिलीकरण11के रूप में पोस्ट-शोधों संशोधनों (PTMs) से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कुल पेप्टाइड्स की तुलना में phosphopeptides के निचले stoichiometric प्रकृति के कारण, कई तरीकों phosphopeptides के लिए समृद्ध करने के लिए कार्यरत हैं, immunoprecipitation (phosphotyrosine) पेप्टाइड्स के एंटीबॉडी-आधारित pY सहित, टाइटेनियम डाइऑक्साइड (TiO2 ), और मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC)5,12. क्योंकि प्रोटीन फास्फारिलीकरण कई सेल संकेतन रास्ते में एक महत्वपूर्ण कदम है, शॉटगन phosphoproteomics शोधकर्ताओं ने13स्तन, प्रोस्टेट14, गुर्दे15सहित विभिन्न प्रकार के कैंसर में परिवर्तन संकेतन सेल की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और डिंबग्रंथि,16,17 बेहतर कैंसर जीवविज्ञान को समझने के लिए और चिकित्सा के लिए संभावित नए लक्ष्य की पहचान करने के लिए ।

इस लेबल मुक्त शॉटगन phosphoproteomic विधि का निर्माण किया गया था और Graeber समूह18,19,20द्वारा पिछले काम के आधार पर परिष्कृत । इस प्रोटोकॉल निष्कर्षण और प्रोटीन और phosphoproteins पेप्टाइड्स में ऊतक से पाचन का वर्णन करने से शुरू होता है । हम तो विस्तार pY पेप्टाइड्स के संवर्धन विशिष्ट phosphotyrosine एंटीबॉडी और TiO2का उपयोग कर । हम भी phosphoserine/threonine (pST) के संवर्धन का वर्णन मजबूत कटियन एक्सचेंज (SCX) TiO2के बाद का उपयोग कर पेप्टाइड्स । इस प्रोटोकॉल एक एमएस सुविधा और एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए नमूनों की प्रस्तुति के साथ समाप्त करने की पहचान करने और phosphopeptides और उनके इसी phosphoproteins यों तो । इस प्रोटोकॉल के आवेदन अंय कैंसर और कैंसर विज्ञान के बाहर खेतों में प्रोस्टेट कैंसर से परे का विस्तार कर सकते हैं ।

Protocol

xenograft ट्यूमर का उपयोग प्रयोगों Rutgers विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के दिशा निर्देशों के तहत उल्लिखित के रूप में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. प्रोटीन निष्कर्षण

  1. lysis बफ़र (तालिका 1) तैयार करें । (मात्रा नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है काटा जा करने के लिए.) इन विट्रो कक्ष नमूनों के लिए, चरण १.२ के लिए आगे बढ़ें । ट्यूमर ऊतक के लिए, १.३ कदम आगे बढ़ना ।
  2. कटाई कक्ष
    1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ७०० x g पर स्पिन । supernatant को त्यागें और गोली बर्फ पर रखें । एक गोली में कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सभी व्यंजन के लिए इस कदम को दोहराएँ । (आमतौर पर, के बारे में 5 लगभग धाराप्रवाह 15-मुख्यमंत्री बर्तन की कोशिकाओं के लिए आवश्यक है 5 प्रोटीन की मिलीग्राम, लेकिन यह सेल लाइन पर निर्भर हो सकता है और एक अंवेषक द्वारा empirically निर्धारित किया जाना चाहिए.)
    2. ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 30 मिलीलीटर और स्पिन के साथ गोली धो 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ७०० x जी पर पंजाब aspirating से पहले । प्रति lysis बफर के १.५ मिलीलीटर जोड़ें 5 प्रोटीन के मिलीग्राम सेल गोली के लिए इस्तेमाल किया । ऊपर और नीचे एक दो बार प्लास्टिक । चरण १.४ पर जाएं ।
  3. ऊतकों की कटाई
    1. ट्यूमर वजन और एक संस्कृति टेस्ट ट्यूब में ऊतक के हर १०० मिलीग्राम के लिए बर्फ ठंडा lysis बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें । (आमतौर पर, ५० से १५० मिलीग्राम ऊतक गीला वजन की जरूरत है.)
  4. Homogenize एक हाथ का उपयोग कर lysate-आयोजित या benchtop homogenizer (15 एस के लिए नाड़ी 2x.) homogenizer पहले नमूने से पहले और नमूनों के बीच 10% ब्लीच, ७०% इथेनॉल का उपयोग करके साफ है, और उत्तराधिकार में जल ।
  5. कम करने और alkylate के लिए, homogenized नमूनों को 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर हीट करें । फिर उंहें 15 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा । बर्फ पर, sonicate lysate 3x (यानी, ६० एस के साथ 30 एस के लिए पल्स दालों के बीच ठहरता है) । इस बिंदु पर नमूना चिपचिपा या झुरमुट नहीं होना चाहिए । 5 मिनट21के लिए ९५ ° c पर lysate गर्मी ।
  6. 15 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर ३,५०० x g पर एक स्विंग बाल्टी रोटर का उपयोग कर एक ही sonication ट्यूब में lysate केंद्रापसारक. supernatant इकट्ठा और गोली त्यागें ।
  7. एक ब्रैडफोर्ड परख22प्रदर्शन से प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण । यदि आवश्यक हो, एक lysis बफर के साथ 5 मिलीग्राम/एमएल के लिए lysate पतला । -20 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर ।
    नोट: प्रयोग यहां ठहर सकता है । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों फ्रीज और एक बाद की तारीख में जारी है ।

2. Lysate पाचन

  1. guanidinium की मात्रा को कम करने के लिए १०० mM Tris (pH = ८.५) का उपयोग करके नमूना 12-फ़ोल्ड को पतला करें । असमान पाचन के प्रभाव को कम करने के लिए सभी नमूनों को एक ही वॉल्यूम पर पतला करें । १२.५ बचाने के लिए एक Coomassie-दाग जेल23पर यह पुष्टि करने के लिए अपच lysate के µ जी ।
  2. के लिए 5 प्रोटीन की मिलीग्राम, Lysyl Endopeptidase के 10 µ जी जोड़ें (Lys-सी) और 5-6 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर यह मशीन 1 मीटर untitrated Tris (पीएच ~ 11) जोड़कर पीएच ८.० को समायोजित करें ।
  3. तैयार 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर की एल-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl कीटोंन (TPCK)-इलाज trypsin 1 मिमी एचसीएल में (20 मिमी CaCl2के साथ) । एक 1:100 trypsin पर trypsin जोड़ें: प्रोटीन अनुपात और यह 3 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  4. २.३ चरण में के रूप में ताज़ा trypsin की समान मात्रा जोड़ें । यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  5. १२.५ बचाने के लिए पच lysate के µ जी एक Coomassie दाग जेल23पर पूर्ण पाचन की पुष्टि करने के लिए ।

3. रिवर्स चरण निष्कर्षण

  1. lysate वॉल्यूम रिकॉर्ड है । 15 मिलीलीटर 10 केडीए कटऑफ फिल्टर का उपयोग कर सैंपल को फिल्टर करें । ३,५०० x g पर नमूना स्विंग बाल्टी रोटर (या एक निश्चित कोण रोटर में ३,५०० एक्स जी) का उपयोग कर 15 डिग्री सेल्सियस तक retentate मात्रा से कम २५० µ l (यह लगभग लेता है ४५-६० मिनट) । प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा और retentate त्यागें ।
    नोट: प्रयोग यहां ठहर सकता है । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों फ्रीज और एक बाद की तारीख में जारी है ।
  2. नमूने को acidify करने के लिए, lysate के लगभग 20 µ l को 5% trifluoroacetic अम्ल (TFA) प्रति मिलीलीटर के रूप में जोड़ें । उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण और पीएच स्ट्रिप्स का उपयोग करके नमूना पीएच उपाय. 5% TFA का उपयोग कर २.५ को पीएच समायोजित करें ।
  3. एक वैक्यूम कई गुना करने के लिए एक सी-18 कॉलम के छोटे अंत कनेक्ट । 17 और ३४ केपीए के बीच शूंय सेट करें (या निर्माता के निर्देशों के अनुसार) । ग्लास पिपेट का प्रयोग कर, १००% acetonitrile (ACN) के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम गीला । कॉलम को सूखने न दें ।
  4. कांच पिपेट का प्रयोग, ०.१% TFA के 6 मिलीलीटर 2x 3 मिलीलीटर के रूप में लागू के साथ कॉलम equilibrate । acidified नमूना स्तंभ में लोड । एक बार में 3 मिलीलीटर से अधिक न जोड़ें । प्रति सेकंड 1 से 2 बूंदों के बारे में लक्ष्य के लिए वैक्यूम समायोजित करें ।
  5. कांच पिपेट का प्रयोग, ०.१% TFA के 9 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो 3x 3 मिलीलीटर के रूप में लागू किया । Elute कॉलम को ४०% ACN, ०.१% TFA के 2 मिलीलीटर के साथ । दो गिलास संस्कृति ट्यूबों में 2 मिलीलीटर अंश लीजिए । स्तंभ को छोड़ें ।
  6. कवर eluate ट्यूबों parafilm और पंच के साथ एक 20G सुई का उपयोग कर कवर पर छेद 3-5 । यह पूरी तरह से ठोस है जब तक सूखी बर्फ पर eluate को कम से कम 30 मिनट के लिए फ्रीज ।
  7. रात भर अंशों को Lyophilize । अगले दिन पर, सुनिश्चित करें कि नमूने lyophilizer रोकने से पहले पूरी तरह से सूख रहे हैं । -८० डिग्री सेल्सियस पर नाजुक पोंछे के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ट्यूबों की दुकान ।
    नोट: प्रयोग यहां ठहर सकता है ।

4. pY पेप्टाइड्स के Immunoprecipitation और संवर्धन24

  1. प्रत्येक अंश में ०.५ मिलीलीटर बर्फ शीत immunoprecipitation (आईपी) बाध्यकारी बफर के साथ lyophilized पाउडर resuspend । पहले अंश के दूसरे अंश से ०.५ मिलीलीटर पुनर्निलंबन मात्रा स्थानांतरित करके और पिपेट टिप को बचाने के लिए भिन्नों को पूल करें । जोरदार भंवर (बजाय ऊपर और नीचे pipetting के) यकीन है कि नमूना पूरी तरह से एक ३.६ मिलीलीटर पेंच टोपी cryotube को स्थानांतरित करने से पहले भंग कर रहा है बनाने के लिए ।
  2. चरण ४.१. में के रूप में, एक ट्यूब में आईपी बाध्यकारी बफर (तालिका 1) के एक और ०.५ मिलीलीटर के साथ lyophilization ट्यूबों कुल्ला । किसी भी नमूना हानि को कम करने के लिए एक ही पिपेट टिप का उपयोग ३.६ एमएल पेंच टोपी ट्यूब के लिए समाधान स्थानांतरण । दोहराएं अधिक कुल्ला 1x, अंतिम निलंबन मात्रा 2 मिलीलीटर (के लिए 5 प्रोटीन की मिलीग्राम) बना । यह लगभग ७.४ है सुनिश्चित करने के लिए नमूना पीएच उपाय । यदि यह भी अंलीय है, iteratively 1m Tris के 10 µ एल जोड़ें (untitrated, पीएच ~ 11) । यदि यह बहुत बुनियादी है, iteratively पतला एचसीएल के 10 µ एल जोड़ें (1:25 या 1:100) ।
  3. पूर्व pY मोती धोने (lysate शुरू करने के 5 मिलीग्राम के लिए)
    1. 4G10 एंटीबॉडी के 25 µ g और १२.५ µ g के 27b 10.4 एंटीबॉडी के प्रति नमूना की जरूरत है । एक कट टिप के साथ एक p200 पिपेट का उपयोग करने के बाद अलग microcentrifuge ट्यूबों में एंटीबॉडी हस्तांतरण, ४५० µ के साथ एंटीबॉडी बर्फ ठंडा आईपी बाध्यकारी बफर 2x के एल धो लो । उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant बाहर महाप्राण ।
    2. ०.५ मिलीग्राम/एमएल के एक शेयर एकाग्रता के लिए मोतियों को resuspend आईपी बाइंडिंग बफर का उपयोग कर । (भंवर मोती मत करो.) aliquoting के बाद आवश्यक घोल (५० µ एल के 4G10 एंटीबॉडी घोल और 25 µ l 27b 10.4 एंटीबॉडी घोल के प्रति नमूना) एक ही ट्यूब में, नीचे स्पिन स्टॉक केंद्रापसारक ट्यूबों पर २०० एक्स जी के लिए 1 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस । मोतियों को फ्रिज में रखने से पहले supernatant के साथ sidewalls को धो लें ।
  4. पेंच टोपी cryotubes में resuspend नमूना समाधान करने के लिए पूर्व धोया pY मोतियों जोड़ें । एक अंत से अधिक अंत रोटेटर रातोंरात पर उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन.
  5. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब एक नाजुक पोंछे के साथ लाइन में पेंच टोपी cryotubes प्लेस । 1 मिनट के लिए १०० x जी में मोतियों नीचे स्पिन । supernatant, जो पीएसटी पेप्टाइड्स के लिए समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा बचाओ । (के लिए संवर्धन पीएसटी चरण 7 पर शुरू होता है और pY पेप्टाइड प्रोसेसिंग के समानांतर में किया जा सकता है) ।
  6. ३०० µ एल के साथ मोती resuspend आईपी बाइंडिंग बफर की । उन्हें एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए उन्हें १०० x g पर नीचे स्पिन ।
  7. आईपी बाइंडिंग बफर के २०० µ एल के साथ मशीन ट्यूब 3x कुल्ला । एक ही Microcentrifuge ट्यूब के लिए सामग्री हर बार स्थानांतरण । फिर उंहें नीचे स्पिन ।
  8. ५०० µ एल के साथ microcentrifuge ट्यूब 3x में मोती धो आईपी बाइंडिंग बफर की और उंहें स्पिन नीचे १०० एक्स जी में 1 मिनट के लिए । फिर 25 मिमी एनएच4HCO3, पीएच ७.५ के ४५० µ एल के साथ मोती 4x धो लें, और उंहें 1 मिनट के लिए १०० x g में नीचे स्पिन । एक ताजा 25 मिमी एनएच4HCO3 पाउडर से हर बार हल का उपयोग करें ।
  9. 1 मिनट के लिए १,५०० x जी में मोती केंद्रापसारक । एक जेल-लोड हो रहा है टिप का उपयोग करें supernatant को पूरी तरह से हटाने के लिए जेल की नोक-मोतियों की सतह के नीचे थोड़ा टिप लोड हो रहा है ।
  10. 4x मनका मात्रा ०.१% TFA के मोतियों को जोड़ें (यानी, pY मनका घोल के ७५ µ जी के लिए ०.१% TFA के ३०० µ एल जोड़ें) । उंहें अच्छी तरह से मिश्रण और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १,००० rpm पर एक thermomixer में मिश्रण गर्मी ।
  11. एक ०.२ µm स्पिन फिल्टर करने के लिए पुनर्निलंबन स्थानांतरण । जल्दी रेफरेंस ट्यूब नीचे स्पिन और एक P10 प्लास्टिक का उपयोग कर एक ही स्पिन फिल्टर करने के लिए अवशिष्ट मात्रा हस्तांतरण । 1 मिनट के लिए ८५० x g पर स्पिन फिल्टर नीचे स्पिन । एक कम प्रोटीन बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब को रेफरेंस हस्तांतरण । वैक्यूम eluate ध्यान केंद्रित करने के लिए ४० डिग्री सेल्सियस पर रात भर सूखापन और ३०० मिनट की एक गर्मी के समय के साथ ।
    नोट: प्रयोग यहां ठहर सकता है । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों फ्रीज और एक बाद की तारीख में जारी है ।

5. टाइटेनियम डाइऑक्साइड संवर्धन pY पेप्टाइड्स की25

  1. ५०% ACN, ०.१% TFA के २०० µ एल में सूख नीचे phosphopeptides resuspend । भंवर और उंहें 30 एस के लिए १०,००० x जी पर केंद्रापसारक इस 1x को दोहराने के लिए उंहें अच्छी तरह से resuspend ।
  2. TiO2 मोतियों की तैयारी सुझाव है कि २०० µ एल नमूनों के लिए एक क्षमता है में निहित ।
    1. धीरे टिप की ओर छोटे टिप पर नल सामग्री है कि अंत करने के लिए ले जाने के लिए । १००% ACN के २०० µ एल जोड़कर टिप कुल्ला, टिप औंधा और छोटे अंत फ़्लिक करने के लिए टोपी की ओर तरल ले जाने के बाद ।
    2. एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, टिप के छोटे टिप में कटौती और यह एक कम प्रोटीन-बाध्यकारी ट्यूबपर जगह है । (polystyrene ट्यूबों के प्रयोग से बचें के रूप में TiO2 ट्यूब के पक्ष में रहना होगा.) कैप निकालें और शेष ACN को बाहर निकालने के लिए एक micropipette डालें । धो को १००% ACN के २०० µ l के साथ दोहराएं । TiO2 मोती अब निम्न चरणों के लिए कम प्रोटीन-बाइंडिंग ट्यूब में स्थित हैं ।
    3. १००% ACN 2x के ५०० µ एल के साथ शर्त TiO2 । प्लास्टिक यह विलायक के साथ मोतियों का मिश्रण करने के लिए । उंहें 1 मिनट के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. हालत ५०० µ एल के साथ TiO2 ०.२ एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच ~ 7) 2x । equilibration बफर 3x के ३०० µ एल के साथ मोतियों को धो लें । क्योंकि TiO2 बहुत घने है, मोती जल्दी से व्यवस्थित हो जाएगा ।
  3. जोड़ें ४०० µ एल के ५०% ACN, ०.१% TFA कम प्रोटीन बाइंडिंग ट्यूब में, लैक्टिक एसिड की ८४ µ एल जोड़ने के बाद. कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूब में resuspend phosphopeptides हस्तांतरण और उंहें 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक अंत से अधिक अंत रोटेटर का उपयोग कर मशीन ।
  4. 1 मिनट के लिए १०० x g पर मोती के लिए उंहें गोली केंद्रापसारक । equilibration बफर (तालिका 1) 2x के ३०० µ एल के साथ उंहें धो लें और उंहें 1 मिनट के लिए १०० x g पर नीचे स्पिन ।
  5. धोने बफर 2x के ३०० µ एल के साथ मोतियों कुल्ला । उंहें एक ०.२ µm स्पिन फिल्टर करने के लिए स्थानांतरण । उंहें 1 मिनट के लिए १,५०० x g पर स्पिन ।
  6. फ़िल्टर इकाई को एक क्लीन १.५ mL कम प्रोटीन-बाइंडिंग ट्यूब पर स्थानांतरित करें । Elute सामग्री 2x के साथ २०० µ l के ०.९% एनएच3 में एच2ओ. उपाय पीएच स्ट्रिप्स के साथ पीएच, जो 10 और 11 के बीच होना चाहिए । वैक्यूम eluate ध्यान केंद्रित करने के लिए रात का सूखापन के लिए अमोनिया लुप्त हो जाना ।

6. एमएस विश्लेषण के लिए pY पेप्टाइड्स लवण

  1. ०.१% TFA के 15 µ एल के साथ phosphopeptides का पुनर्गठन और उंहें 30 एस के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक उंहें reconstitut करने के लिए । उंहें अच्छी तरह से resuspend करने के लिए इस 1x दोहराएँ । ऊपर और नीचे मत पिपेट ।
  2. 5 µ जी की एक बाध्यकारी क्षमता के साथ एक सी-18 टिप का उपयोग कर नमूना साफ और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
  3. पूरी तरह से वैक्यूम एकाग्रता द्वारा रेफरेंस मात्रा सूखी । यह लेता है 1-2 ज. जन स्पेक्ट्रोमेट्री समाधान के १२.५ µ l में सूखे phosphopeptides resuspend ( 1 तालिकादेखें) (या के रूप में शोधकर्ता सुश्री प्रोटियोमिक् कोर सुविधा द्वारा अनुशंसित) । भंवर और संक्षेप में समाधान स्पिन 30 एस के लिए १०,००० एक्स जी में नीचे इस 2x दोहराने के लिए उंहें अच्छी तरह से resuspend । नमूनों को जन स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा (चरण 11) में प्रस्तुत करने के लिए तैयार हैं ।
    नोट: निंन चरणों का पालन पीएसटी पेप्टाइड संवर्धन के लिए ही संबंधित हैं ।

7. पीएसटी पेप्टाइड्स के रिवर्स चरण निष्कर्षण

  1. एक पेप्टाइड परख प्रदर्शन से ४.६ कदम से अधिग्रहीत supernatant के पेप्टाइड एकाग्रता को मापने । पीएसटी मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक पर्याप्त राशि २.५ मिलीग्राम है ।
  2. 5% TFA के साथ ३.५ के लिए पीएच समायोजित करें ।
  3. एक वैक्यूम कई गुना करने के लिए एक सी-18 कॉलम के छोटे अंत कनेक्ट । 17 और ३४ केपीए के बीच शूंय सेट करें (या निर्माता के निर्देशों के अनुसार) । १००% ACN के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम गीला । कॉलम को सूखने न दें ।
  4. Equilibrate ०.१% के 6 मिलीलीटर के साथ कॉलम 2x 3 मिलीलीटर के रूप में लागू TFA । acidified नमूना स्तंभ में लोड । एक बार में 3 मिलीलीटर से अधिक न जोड़ें । प्रति सेकंड 1-2 बूंदों के बारे में लक्ष्य करने के लिए वैक्यूम समायोजित करें ।
  5. 3x 3 मिलीलीटर के रूप में लागू ०.१% TFA के 9 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लें । Elute कॉलम को ४०% ACN, ०.१% TFA के 2 मिलीलीटर के साथ । दो गिलास संस्कृति ट्यूबों में 2 मिलीलीटर अंश लीजिए । स्तंभ को छोड़ें ।
  6. कवर eluate ट्यूबों parafilm और पंच के साथ एक 20G सुई का उपयोग कर कवर पर छेद 3-5 । यह पूरी तरह से ठोस है जब तक सूखी बर्फ पर eluate को कम से कम 30 मिनट के लिए फ्रीज ।
  7. चुनिंदा अंशों को रातोंरात Lyophilize. अगले दिन पर, सुनिश्चित करें कि नमूने lyophilizer रोकने से पहले पूरी तरह से सूख रहे हैं । -८० डिग्री सेल्सियस पर नाजुक पोंछे के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ट्यूबों की दुकान ।
    नोट: प्रयोग यहां ठहर सकता है ।

8. मजबूत कटियन एक्सचेंज (SCX) पीएसटी पेप्टाइड्स की

  1. एक (तालिका 1) बफर के 2 मिलीलीटर में lyophilized पेप्टाइड्स resuspend । प्रत्येक नमूने के लिए भिंन पूल । (समाधान बादल छाए रहेंगे.)
  2. निर्वात कई गुना तैयार करें । एक SCX कॉलम से कनेक्ट गोताख़ोर के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज को हटा दिया । 17 और ३४ केपीए के बीच शूंय सेट करें (या निर्माता के निर्देशों के अनुसार) ।
  3. शर्त SCX कॉलम ACN के 4 मिलीलीटर, बफर A के 4 मिलीलीटर के बाद के साथ ।
  4. ८.१ चरण से नमूने के 2 मिलीलीटर लोड और eluate तुरंत इकट्ठा । A:B (80.9:19.1) बफर के 3 मिलीलीटर लोड और eluate इकट्ठा । प्रत्येक नमूने के eluates पूल और उंहें 2 मिलीलीटर कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूबों में aliquot ।
  5. वैक्यूम मात्रा के लगभग 30% तक सभी नमूनों ध्यान केंद्रित रहता है । (यह चरण लगभग 2-4 h लेता है.) प्रत्येक नमूने के लिए 1 कम प्रोटीन-बाइंडिंग ट्यूब में aliquots पूल ।
  6. एक वैक्यूम कई गुना करने के लिए एक सी-18 कॉलम के छोटे अंत कनेक्ट । 17 और ३४ केपीए के बीच शूंय सेट करें (या निर्माता के निर्देशों के अनुसार) । १००% ACN 2x के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम गीला । कॉलम को सूखने न दें ।
  7. ०.१% TFA 2x के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम Equilibrate । नमूना स्तंभ में लोड । एक बार में 3 मिलीलीटर से अधिक न जोड़ें । प्रति सेकंड 1-2 बूंदों के बारे में लक्ष्य करने के लिए वैक्यूम समायोजित करें ।
  8. ०.१% TFA 2x के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लें । Elute कॉलम को ५०% ACN, ०.१% TFA के 4 मिलीलीटर के साथ ।

9. टाइटेनियम डाइऑक्साइड संवर्धन पीएसटी पेप्टाइड्स की

  1. TiO2 मोतियों की तैयारी युक्तियां में निहित है कि २०० µ एल नमूनों के लिए एक क्षमता है
    1. धीरे टिप के छोटे टिप ओर नल कि अंत करने के लिए मोतियों को स्थानांतरित करने के लिए । टोपी निकालें और एक के मोती में 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब डालना ।
    2. १००% ACN के २०० µ एल जोड़कर टिप कुल्ला, टिप एक दो बार पलटना और छोटे अंत फ़्लिक करने के लिए टोपी की ओर तरल चाल । एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, टिप के छोटे टिप में कटौती और यह पर जगह 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब । कैप निकालें और शेष ACN को बाहर निकालने के लिए एक micropipette डालें । धो को १००% ACN के २०० µ l के साथ दोहराएं । TiO2 मोतियों अब निंनलिखित चरणों के लिए 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थित हैं ।
    3. १००% ACN 2x के ५०० µ एल के साथ शर्त TiO2 । प्लास्टिक यह विलायक के साथ मोतियों का मिश्रण करने के लिए । उंहें 1 मिनट के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. हालत ५०० µ एल के साथ TiO2 ०.२ एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच ~ 7) दो बार । equilibration बफर 3x के ३०० µ एल के साथ मोतियों को धो लें ।
  2. eluted phosphopeptides के लिए 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरण । लैक्टिक एसिड के ५६० µ एल जोड़ें और एक अंत में खत्म-से अंत रोटेटर का उपयोग कर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए यह मशीन ।
  3. 1 मिनट के लिए १०० x g पर मिश्रण केंद्रापसारक को मोतियों की गोली । equilibration बफर (तालिका 1) 3x के ३०० µ l के साथ उंहें धो लें । उंहें १०० पर 1 मिनट के लिए एक्स जी नीचे स्पिन ।
  4. धोने बफर 2x के ३०० µ एल के साथ मोतियों कुल्ला । उंहें एक ०.२ µm स्पिन फिल्टर करने के लिए स्थानांतरण । उंहें १,५०० पर 1 मिनट के लिए एक्स जी नीचे स्पिन ।
  5. फ़िल्टर इकाई को एक क्लीन १.५ mL कम प्रोटीन-बाइंडिंग ट्यूब पर स्थानांतरित करें । Elute सामग्री 2x के साथ २०० µ एल के ०.९% एनएच3 में एच2ओ. समाधान दो उंहें eluting से पहले मिनट के लिए phosphopeptides पर बैठते हैं । उपाय पीएच, जो 10 और 11 के बीच होना चाहिए ।
  6. वैक्यूम eluate ध्यान केंद्रित करने के लिए रात का सूखापन के लिए अमोनिया लुप्त हो जाना ।

10. एमएस विश्लेषण के लिए पीएसटी पेप्टाइड्स

  1. धीरे टिप की ओर छोटे टिप पर नल सामग्री है कि अंत करने के लिए ले जाने के लिए । १००% ACN के २०० µ एल जोड़कर टिप कुल्ला, टिप औंधा और छोटे अंत फ़्लिक करने के लिए टोपी की ओर तरल ले जाने के बाद ।
  2. एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, टिप के छोटे टिप में कटौती और यह एक से अधिक जगह 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब। कैप निकालें और शेष ACN को बाहर निकालने के लिए एक micropipette डालें । धो को १००% ACN के २०० µ l के साथ दोहराएं । TiO2 मोती अब निंनलिखित चरणों के लिए 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थित हैं ।
  3. १०० µ जी (निर्माता के निर्देशों का पालन करें) की बाध्यकारी क्षमता के साथ एक सी 18 टिप का उपयोग कर नमूना साफ ।
  4. पूरी तरह से वैक्यूम एकाग्रता द्वारा रेफरेंस मात्रा सूखी । इस लेता है 1-2 ज.
  5. (या के रूप में शोधकर्ता सुश्री प्रोटियोमिक् कोर सुविधा द्वारा अनुशंसित) जन स्पेक्ट्रोमेट्री समाधान के १२.५ µ l में सूखे phosphopeptides resuspend । भंवर और उंहें 30 एस दोहराने 2x के लिए १०,००० x g पर उंहें अच्छी तरह से resuspend । (ऊपर और नीचे पिपेट नहीं है.)

11. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

  1. एमएस प्रोटियोमिक् कोर सुविधा के लिए नमूने जमा करने के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर एमएस (LC-ms/ उदाहरण सेटिंग्स निंनानुसार हैं (सारांश के लिए तालिका 2 देखें):
    1. एक जाल कॉलम (2 सेमी लंबी x ७५ µm व्यास) पर नमूनों की 5 µ एल लोड और 5 µ एल के एक प्रवाह की दर के साथ 5 मिनट के लिए ०.१% TFA के साथ उन्हें धो/
    2. एक नैनो विश्लेषणात्मक कॉलम के साथ लाइन में जाल लाओ (20 सेमी x ७५ µm) के प्रवाह की दर के साथ ३०० nL/
    3. pY और pST नमूनों के बीच विभाजित रेखीय ग्रेडिएंट्स (०.१६% प्रपत्र वाला अंल, ०.२% ACN एसिड में ८०% का प्रतिशत) भिन्न होते हैं:
      1. pY नमूनों के लिए, elute उंहें 5 मिनट में 4-15%, ४० मिनट में 15-50% की एक ढाल का उपयोग कर, और ५०-९०% 5 मिनट में ।
      2. पीएसटी नमूनों के लिए, उंहें elute 30 मिनट में 4-15%, ४० मिनट में 15-25%, ४४ मिनट में 25-50%, और 11 मिनट में ५०-९०% की एक ढाल का उपयोग कर ।
    4. १२०,००० के एक संकल्प के साथ एक पूर्ण स्कैन की एक चक्रीय श्रृंखला के साथ डेटा-निर्भर अधिग्रहण मोड में एमएस डेटा हासिल एमएस/ms (HCD, रिश्तेदार टक्कर ऊर्जा के 27%) के 20 सबसे तीव्र आयनों और एक गतिशील अपवर्जन अवधि के 20 एस के बाद.
  2. एमएस चलाने के पूरा होने के बाद, एक एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में एमएस रॉ फ़ाइलें आयात करने के लिए पहचान और मात्रा phosphopeptides । (MaxQuant सॉफ्टवेयर8,26,27 का प्रयोग इस प्रयोग में किया गया । तालिका 3में निर्दिष्ट किए जाने तक, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग किया गया था.)

Representative Results

इस प्रोटोकॉल विस्तार से प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन phosphopeptide संवर्धन और बाद एमएस विश्लेषण (चित्रा 1) के बाद के लिए एक विधि का वर्णन । सभी बफ़र्स और समाधान इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाते है जो की रचनाएं तालिका 1में सूचीबद्ध हैं । Lys-सी और trypsin का क्रमिक उपयोग एक कुशल पाचन प्रदान करता है । पूर्व पचा lysate के एक Coomassie-दाग जेल प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करता है, जबकि पोस्ट के दाग-पच lysate पूरा पाचन की पुष्टि करता है (चित्रा 2a) । एक पूर्ण पाचन के लिए, कोई बैंड 15 केडीए के ऊपर दिखाई देना चाहिए, 30 केडीए और २३.३ केडीए बैंड को छोड़कर Lys-सी और trypsin के लिए क्रमशः. Lys-सी के अलावा छूटे हुए क्लीवेज की संख्या भी कम होती है (फिगर बी. ए.). क्योंकि pY पेप्टाइड्स phosphoproteome28का केवल 2% का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक pY-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर pY पेप्टाइड्स के immunoprecipitation pY पेप्टाइड संवर्धन का पहला कदम है । परिणामस्वरूप supernatant पीएसटी पेप्टाइड संवर्धन के लिए इनपुट हो जाता है । pY immunoprecipitation प्रभावी ढंग से pY पेप्टाइड्स से अलग है पीएसटी पेप्टाइड्स जहां pY तैयारी से पहचान की phosphopeptides के औसत ८५% पर pY है (3 ए आंकड़ा) और से अधिक ९९% phosphopeptides की पहचान पीएसटी तैयारी कर रहे है pST (चित्र बी) । टाइटेनियम डाइऑक्साइड दोनों की तैयारी में phosphopeptides के लिए समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एमएस तैयार तैयारी है कि phosphorylated है में पेप्टाइड्स की उंमीद प्रतिशत 30-50% (चित्रा 4a) के बीच है । phosphopeptide संवर्धन प्रतिशत में परिवर्तनशीलता pY तैयारी में अधिक हो सकता है वहां का एक परिणाम के रूप में पीएसटी पेप्टाइड्स से कई कम pY पेप्टाइड्स जा रहा है । phosphopeptide प्रजातियों के मामले में, phosphopeptides के बहुमत का पता चला एक एकल या डबल phosphoryl समूह (चित्रा 4B) है ।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन करने के बाद, एमएस रॉ फ़ाइलें एक एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लोड कर रहे हैं । प्रयोग में प्रयुक्त पैरामीटर सेटिंग तालिका 3 में सूचीबद्ध हैं, लेकिन सॉफ़्टवेयर से सॉफ़्टवेयर में भिंन होंगी और संस्करण से संस्करण में भिंन हो सकती हैं । जो पैरामीटर्स सूचीबद्ध नहीं हैं, वे डिफ़ॉल्ट के रूप में छोड़ दिए गए थे, जिनमें पेप्टाइड-स्पेक्ट्रम मिलान (PSM) के लिए 1% का एफडीआर कटऑफ संशोधित पेप्टाइड्स की पहचान के लिए ४० के न्यूनतम एंड्रोमेडा स्कोर के साथ27. लगभग 5% pY पेप्टाइड्स और 15% और pS और पीटी पेप्टाइड्स, क्रमशः (चित्र 5) के ३४% बाहर से अधिक की स्थानीयकरण प्रायिकता कटऑफ सेट कर रहा है । इन फिल्टर लागू करने के बाद, एमएस विश्लेषण के अंत में phosphopeptide पहचान की उंमीद की संख्या लगभग ३०० pY पेप्टाइड्स (के लिए शुरू प्रोटीन की 5 मिलीग्राम) और के बारे में ७,५०० pS पेप्टाइड्स और ६४० पीटी पेप्टाइड्स (के लिए २.५ मिलीग्राम शुरू पेप्टाइड राशि) से संबंधित संवर्धन की तैयारियों (figure 5B) से. दोहराने की संख्या और phosphopeptide संकेत तीव्रता की परिवर्तनशीलता सांख्यिकीय तुलना के लिए पर्याप्त शक्ति निर्धारित करता है । या तो जैविक डुप्लिकेट या triplicates वाले समूहों के साथ चार पृथक प्रयोगों में, पता phosphopeptides के लिए भिंनता (% CV) के प्रतिशत गुणांकों की गणना की गई । निचली परिवर्तनशीलता का वितरण (उदा., pST समूह 1-5 चित्रा 5Cमें) इंगित करते हैं कि नमूना संग्रह, तैयारी और मास-स्पेक्ट्रोमेट्री रन एकरूप थे. दूसरी ओर, उच्च परिवर्तनशीलता के वितरण (जैसे, चित्रा 5Cमें पीएसटी समूह 6) noisier डेटा है कि बड़ा गुना-परिवर्तन बहाव विभेदक विश्लेषण में महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए की आवश्यकता होगी इंगित करता है ।

Figure 1
चित्र 1: कार्यप्रवाह आरेख । नमूनों से प्रोटीन निकाले जाते हैं और पचा जाते हैं. पेप्टाइड्स ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) द्वारा निकाले जाते हैं, और phosphotyrosine (pY) पेप्टाइड्स immunoprecipitated हैं । समानांतर में, phosphoserine/threonine (pST) पेप्टाइड्स pY immunoprecipitation चरण में supernatant से समृद्ध हैं । मजबूत कटियन एक्सचेंज (SCX) supernatant पर प्रदर्शन के लिए उच्च चार्ज पेप्टाइड्स हटाने के लिए आयन दमन12को कम किया जाता है । दोनों की तैयारी टाइटेनियम डाइऑक्साइड (TiO2) के माध्यम से phosphopeptide संवर्धन गुजरना । नमूना क्लीनअप के बाद, तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ms/ms) phosphopeptide बहुतायत को मापने के लिए किया जाता है । कच्चे डेटा तो एक एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर में भरी हुई है phosphopeptides की पहचान । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पाचन का मूल्यांकन । (क) lysate पूर्व पाचन के १२.५ µ जी के साथ तीन नमूने, पोस्ट-Lys-सी पाचन, और पोस्ट-trypsin पाचन दिखाया जाता है । एक Coomassie जेल-दाग परीक्षण Lys-सी और trypsin के अनुक्रमिक उपयोग के बाद एक साफ पाचन से पता चलता है । आणविक भार (मेगावाट) आकार मार्करों kilodaltons (केडीए) में हैं. (ख) Lys-सी प्रोटोकॉल में जोड़ा गया था के बाद याद किया दरारें में एक कमी मनाया जाता है । याद दरारें बिना phosphopeptides का प्रतिशत ४८% से ६४% और ६०% से ८४% करने के लिए औसत पर pY और पीएसटी संवर्धन की तैयारी के लिए, क्रमशः वृद्धि हुई । रेखांकन Lys के बिना प्रदर्शन दो प्रयोगों से प्राप्त डेटा का सारांश-सी और पांच प्रयोगों Lys-सी के साथ प्रदर्शन किया. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ३८ pY और ३८ pst नमूनों से 2 अलग प्रयोगों (बिना Lys-c) और ६२ pY और ६० pst नमूनों से 5 अलग-(साथ Lys-c). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: pY और पीएसटी phosphopeptides के संवर्धन । इन पैनलों या तो (एक) pY या (ख) पीएसटी संवर्धन की तैयारी से pSTY phosphopeptides के प्रतिशत दिखाओ । pY immunoprecipitation और टाइटेनियम डाइऑक्साइड द्वारा pY संवर्धन pY पेप्टाइड्स के लिए किया जा रहा ८५% phosphopeptides के परिणामस्वरूप, जबकि पीएसटी संवर्धन में phosphopeptides के केवल ०.१% pY हैं । ये मान Phospho (STY) साइट्स. txt फ़ाइल दूषित, उल्टे दृश्यों, और phosphopeptides से कम ०.७५ स्थानीयकरण संभावनाओं के साथ फ़िल्टर करने के बाद एक प्रतिनिधि प्रयोग के लिए का परीक्षण करने से आरेखित किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: टाइटेनियम डाइऑक्साइड के साथ Phosphopeptide संवर्धन । (A) चार पृथक प्रयोगों में नमूनों से पया phosphopeptides (कुल पेप्टाइड्स के सापेक्ष) का प्रतिशत दिखाया जाता है. (ख) यह पैनल चार पृथक प्रयोगों में मोनो-, डबल, और मल्टी-phosphorylated पेप्टाइड्स की औसत रचना दिखाता है. पैनल में त्रुटि सलाखों के एक मानक विचलन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: phosphoresidue पहचान अपेक्षित । (क) इस पैनल pY संवर्धन से आईडी के फास्फारिलीकरण स्थानीयकरण संभावनाओं से पता चलता है (बाएं) और पीएसटी संवर्धन (दाएं) । > ०.७५ प्रायिकता कटऑफ को पूरा करने वाली id का माध्य प्रतिशत क्रमश: ९३%, ७५%, और pY, pS, और पॉइंट के लिए ५२% है । (ख) एक के साथ आईडी की मतलब संख्या > 0.75 स्थानीयकरण संभावना pY, pS के लिए ७,५०० के लिए ३०० है, और pT के लिए ६४० । (ग) यह पैनल phosphopeptides की भिन्नता (% CV) के प्रतिशत गुणांक के वायलिन भूखंड दिखाता है. % CV का मूल्यांकन केवल तभी किया गया था जब प्रत्येक जैविक प्रतिकृति या तपसिल समूह में एक संकेत तीव्रता मान पाया गया था । डेटा चार अलग प्रयोगों से लिया गया. पैनल में त्रुटि सलाखों के एक और बी 4 अलग प्रयोगों से ३४ pY और ३४ पीएसटी नमूनों से मानक विचलन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बफ़र वॉल्यूम संरचना
6 M guanidinium क्लोराइड lysis बफर ५० एमएल 6 एम guanidinium क्लोराइड, १०० मिमी tris पीएच ८.५, 10 मिमी tris (2-carboxyethyl) phosphine, ४० मिमी chloroacetamide, 2 मिमी सोडियम orthovanadate, २.५ मिमी सोडियम pyrophosphate, 1 मिमी β-glycerophosphate, ५०० मिलीग्राम n-octyl-ग्लाइकोसाइड, मात्रा करने के लिए अल्ट्रा शुद्ध पानी
१०० मिमी सोडियम pyrophosphate ५० एमएल २.२३ ग्राम सोडियम pyrophosphate decahydrate, अल्ट्रा मात्रा को शुद्ध पानी
1m β-glycerophosphate ५० एमएल १५.३१ g β-glycerophosphate, मात्रा करने के लिए अल्ट्रा शुद्ध पानी
5% trifluoroacetic अम्ल 20 मिलीलीटर 19 मिलीलीटर अल्ट्रा शुद्ध पानी में १००% trifluoroacetic एसिड की 1 मिलीलीटर जोड़ें
०.१% trifluoroacetic अम्ल २५० एमएल २४५ मिलीलीटर अल्ट्रा शुद्ध पानी के लिए 5 मिलीलीटर 5% trifluoroacetic एसिड जोड़ें
pY रेफरेंस बफर २५० एमएल ०.१% trifluoroacetic एसिड, ४०% acetonitrile, अल्ट्रा शुद्ध पानी की मात्रा
पीएसटी रेफरेंस बफर २५० एमएल ०.१% trifluoroacetic एसिड, ५०% acetonitrile, अल्ट्रा शुद्ध पानी की मात्रा
IP बाइंडिंग बफ़र २०० एमएल ५० मिमी tris पीएच ७.४, ५० मिमी सोडियम क्लोराइड, अल्ट्रा शुद्ध पानी की मात्रा
25 एमएम अमोनियम बिकारबोनिट, पीएच ७.५ 10 मिलीलीटर भंग १९.७ 10 मिलीलीटर बाँझ अल्ट्रा शुद्ध पानी में मिलीग्राम, 1 N हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ ७.५ करने के लिए पीएच (~ 10-15 µ l/10 मिलीलीटर समाधान), ताजा बनाने
1m फॉस्फेट बफर, पीएच 7 १,००० एमएल ४२३ एमएल 1 एम सोडियम dihydrogen फॉस्फेट, ५७७ मिलीलीटर 1 मीटर सोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट
Equilibration बफर 14 एमएल ६.३ एमएल acetonitrile, २८० µ एल 5% trifluoroacetic एसिड, १७४० µ l लैक्टिक एसिड, ५.६८ मिलीलीटर अल्ट्रा शुद्ध पानी
बफर कुल्ला 20 मिलीलीटर 9 मिलीलीटर acetonitrile, ४०० µ एल 5% trifluoroacetic एसिड, १०.६ मिलीलीटर अल्ट्रा शुद्ध पानी
जन स्पेक्ट्रोमेट्री समाधान 10 मिलीलीटर ५०० µ l acetonitrile, २०० µ l 5% trifluoroacetic अम्ल, ९.३ मिलीलीटर अल्ट्रा शुद्ध पानी
बफ़र A २५० एमएल 5 मिमी monopotassium फॉस्फेट (पीएच २.६५), 30% acetonitrile, 5 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, मात्रा करने के लिए अल्ट्रा शुद्ध पानी
बफ़र B २५० एमएल 5 मिमी monopotassium फॉस्फेट (पीएच २.६५), 30% acetonitrile, ३५० मिमी पोटेशियम क्लोराइड, अल्ट्रा शुद्ध पानी की मात्रा करने के लिए
०.९% अमोनियम हीड्राकसीड 10 मिलीलीटर ३०० μL २९.४२% अमोनियम हीड्राकसीड, ९.७ mL अल्ट्रा-प्योर वॉटर

तालिका 1: बफ़र्स और समाधान । यह तालिका इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए बफ़र्स और समाधानों की रचनाओं को दिखाती है ।

LC-ms/
पैरामीटर pY सेटिंग pST सेटिंग
नमूना लोड हो रहा है (µ एल) 5
लोड हो रहा है प्रवाह दर (µ l/ 5
ग्रैडिएंट प्रवाह दर (nL/ ३००
रैखिक ढाल (प्रतिशत ०.१६% फार्म का अंल, ८०% ACN% फार्मिक एसिड में) 5 मिनट के लिए 4-15% 30 मिनट के लिए 4-15%
४० मिनट के लिए 15-50% ४० मिनट के लिए 15-25%
५०-5 मिनट के लिए ९०% ४४ मिनट के लिए 25-50%
५०-11 मिनट के लिए ९०%
पूर्ण स्कैन रिज़ॉल्यूशन १२०,०००
सबसे तीव्र आयनों की संख्या चयनित 20
सापेक्ष टक्कर ऊर्जा (%) HCD 27
डायनेमिक बहिष्करण (s) 20

तालिका 2: LC-MS सेटिंग्स । यह एक ठेठ शॉटगन phosphoproteomic प्रयोग में LC-MS सेटिंग्स का एक उदाहरण है । नमूने एक ट्रैप स्तंभ पर लोड किए गए थे । जाल में एक विश्लेषणात्मक कॉलम के साथ लाइन लाया गया था । ये सेटिंग्स सामग्री और रिएजेंट की तालिकामें सूचीबद्ध LC-MS सिस्टम का उपयोग करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किए गए थे । इन सेटिंग्स को अंय नियंत्रण रेखा-एमएस सिस्टम के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी ।

MaxQuant पैरामीटर सेटिंग्स
सेटिंग कार्रवाई
समूह-विशिष्ट पैरामीटर्स
प्रकार प्रकार मानक का चयन करें
बहुलता 1 पर सेट
पाचन मोड एंजाइम Select Trypsin/पी
अधिकतम. छूटे हुए क्लीवेज 2 पर सेट
संशोधन परिवर्तनीय संशोधन Add Phospho (STY)
लेबल-मुक्त ठहराव लेबल-मुक्त ठहराव LFQ का चयन करें
LFQ min. अनुपात गणना 1 पर सेट
फ़ास्ट LFQ बंद की जांच
विविध फिर-यों बंद की जांच
वैश्विक पैरामीटर्स
दृश्यों फसता फ़ाइलें Select फसता फाइल UniProt से डाउनलोड की गई
फिक्स्ड संशोधनों Carbamidomethyl जोड़ें (C)
अभिभाषक. पहचान रन के बीच मैच बंद की जांच
मैच समय विंडो 5 मिनट के लिए सेट करें
संरेखण समय विंडो 20 मिनट के लिए सेट करें
अज्ञात सुविधाओं से मेल खाता है बंद की जांच
प्रोटीन ठहराव Min. अनुपात गणना 1 पर सेट
फ़ोल्डर स्थान तदनुसार संशोधित करें

तालिका 3: MS विश्लेषण सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स । MaxQuant में, इस तालिका में समूह-विशिष्ट और वैश्विक पैरामीटर्स चयनित या समायोजित किए गए थे । अंय सभी मापदंडों डिफ़ॉल्ट पर बने रहे । इन प्रयोगों संस्करण 1.5.3.30 का उपयोग कर आयोजित किया गया । पैरामीटर संस्करण से संस्करण और सॉफ्टवेयर के लिए सॉफ्टवेयर से भिन्न हो सकते हैं.

Discussion

phosphopeptides, प्रयोगात्मक डिजाइन के एक सावधान विचार के लिए समृद्ध करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले महत्वपूर्ण है । जैविक प्रतिकृति का उपयोग एक अधिक लागत प्रभावी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री संसाधनों का उपयोग तकनीकी प्रतिकृति से है । प्रतिकृति की संख्या जो आवश्यक है डेटा की परिवर्तनशीलता पर भाग में निर्भर करेगा । हाल के एक अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि, जबकि तीन से परे दोहराने की संख्या में वृद्धि केवल मामूली पहचान की संख्या बढ़ जाती है, समूहों के बीच महत्वपूर्ण पहचान की संख्या बढ़ जाती है और10के साथ प्रतिकृति ।

सेल में phosphoproteins की कम बहुतायत के कारण, पर्याप्त प्रारंभिक प्रोटीन मात्रा डिस्कवरी मोड में प्रोस्टेट कैंसर के नमूनों से एक वैश्विक phosphoproteome प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । इन प्रयोगों में 5 मिलीग्राम प्रोटीन का इस्तेमाल किया गया । लगभग पांच कोशिकाओं के 15 सेमी व्यंजन करीब के रूप में इस प्रोटोकॉल में इनपुट के रूप में पर्याप्त प्रोटीन प्रदान करते हैं, हालांकि इस सेल लाइन पर निर्भर होगा । ट्यूमर ऊतक के लिए के रूप में, प्रोटीन की उंमीद उपज ऊतक वजन के बारे में 6-8% है । में इन विट्रो सेटिंग में, एक सकारात्मक नियंत्रण नमूना पर विचार करने के लिए 1 mM vanadate के अतिरिक्त 30 मिनट के लिए कोशिकाओं संचयन से पहले है । Vanadate, एक प्रतियोगी प्रोटीन phosphotyrosyl फॉस्फेट अवरोधक, tyrosine फास्फारिलीकरण की रक्षा करेगा, इस प्रकार pY पेप्टाइड की संख्या में वृद्धि29पहचान ।

स्वच्छ पाचन phosphopeptide पहचान को अधिकतम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । Coomassie दाग परीक्षण के अलावा, डेटा में चूक दरारें का प्रतिशत पाचन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (चित्रा 2). गुणवत्ता नियंत्रण सॉफ्टवेयर उपलब्ध है कि छूटी दरारें और अंय मैट्रिक्स का विश्लेषण करने के लिए एमएस डाटा गुणवत्ता30का आकलन है । जबकि trypsin सबसे आम है, वैकल्पिक proteome जहां इष्टतम tryptic पेप्टाइड्स31उत्पंन नहीं किया जा सकता में कवरेज अंतराल पता करने के लिए5 उपलब्ध हैं । एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर की सेटिंग्स तो जरूरत के अनुरूप संशोधित करने के लिए एक बार में परिवर्तन के लिए समायोजित किया जाएगा ।

प्रोटोकॉल immunoprecipitation रोजगार (pY संवर्धन के लिए) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से टाइटेनियम डाइऑक्साइड (TiO2) phosphopeptides के लिए समृद्ध करने के लिए । पेप्टाइड्स के लिए समृद्ध करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण शामिल मैटीरियल धातु संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC), धातु ऑक्साइड संबध क्रोमैटोग्राफी के लिए अन्य धातु आक्साइड (MOAC) जैसे एल्यूमिनियम हीड्राकसीड, और बहुलक आधारित धातु आयन संबंध कैप्चर (PolyMAC) 5,12. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि विभिंन संवर्धन तरीकों३२phosphopeptides के विभिंन आबादियों के लिए समृद्ध । उदाहरण के लिए, IMAC और अधिक बहु phosphorylated पेप्टाइड्स को समृद्ध करती है जबकि MOAC अधिमानतः मोनो phosphorylated पेप्टाइड्स३३के लिए समृद्ध । इस प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि परिणाम इस प्रेक्षण (figure4B) को प्रतिबिंबित करते हैं । हाल के एक प्रकाशन का प्रदर्शन किया है कि IMAC और MOAC एक संकर सामग्री का उपयोग संभावित phosphopeptide प्रजातियों३४की अधिक से अधिक कवरेज प्रदान कर सकता है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को समानांतर में अंय संवर्धन तरीकों का उपयोग करने के लिए और भी अधिक व्यापक phosphoproteomic विश्लेषण के लिए अनुमति संशोधित किया जा सकता है ।

MaxQuant26 सॉफ्टवेयर सुइट के लिए इस प्रोटोकॉल में एमएस डेटा का विश्लेषण किया जाता है, लेकिन व्यावसायिक अनुप्रयोगों३५ phosphopeptide पहचान और ठहराव के लिए भी उपलब्ध हैं । phosphopeptide पहचान के लिए, स्थानीयकरण प्रायिकता कटऑफ लागू किया जाता है । यह फ़िल्टर phosphoresidue पहचान10,28में एक उच्च विश्वास (यानी, ०.७५ से अधिक) के साथ phosphopeptides के लिए चयन करने के लिए किया जाता है । दूसरे शब्दों में, phospho-समूह संभावित रूप से हो सकता है अंय सभी अवशेषों की अभिव्यक्त प्रायिकता ०.२५ से कम है । phosphopeptide चयन के stringency को बढ़ाने के लिए यह कटऑफ उठाया जा सकता था । पहचान की संख्या के संबंध में, pY पेप्टाइड्स की अपेक्षित संख्या सैकड़ों में है, जबकि पीएसटी पेप्टाइड्स की अपेक्षित संख्या उच्च हजारों में है । ये मान प्रतिबिंबित पहले phosphoproteome वितरण जहां के बारे में 2%, 12%, और phosphosites के ८६% pY, pT, और pS, क्रमशः28हैं ।

यदि pY और पीएसटी संवर्धन कदम समानांतर में प्रदर्शन कर रहे हैं, नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में कदम छह दिनों में पूरा किया जा सकता है । एमएस के शक्तिशाली उपकरण के साथ बाँधना द्वारा, phosphopeptide संवर्धन प्रोटोकॉल जैसे यह वैज्ञानिकों के लिए एक वैश्विक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए अपने संबंधित अनुसंधान क्षेत्रों में phosphoproteome विश्लेषण डेटा इकट्ठा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर सलाह और इनपुट प्रदान करने के लिए ड्रेक लैब के सदस्यों को धन्यवाद । हम भी रॉबर्ट वुड जॉनसन मेडिकल स्कूल और Rutgers, ंयू जर्सी के राज्य विश्वविद्यालय के जैविक जन स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा के सदस्यों को सलाह प्रदान करने और हमारे नमूनों पर जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन के लिए धंयवाद । लैरी सी चेंग पुरस्कार संख्या T32 GM008339 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य के संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित है । थॉमस जी Graeber NCI/NIH (प्रोस्टेट कैंसर P50 CA092131 में बीजाणु द्वारा समर्थित है; P01 CA168585) और एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च विद्वान पुरस्कार (RSG-12-257-01-TBE) । जस्टिन एम ड्रेक रक्षा प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम W81XWH-15-1-0236, प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन यंग अंवेषक पुरस्कार, ंयू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन, और Rutgers से एक प्रेसिजन चिकित्सा पहल पायलट पुरस्कार के विभाग द्वारा समर्थित है ंयू जर्सी के कैंसर संस्थान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra-Low Temperature Freezer Panasonic MDF-U76V
Freezer -20 °C VWR scpmf-2020
Swing rotor bucket ThermoFisher Scientific 75004377
Vacuum manifold Restek 26080
Lyophilizer Labconco 7420020
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator Labconco 7810010
End-over-end rotator ThermoFisher Scientific 415110Q
Razor blade Fisher Scientific 620177
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore Sigma UFC901024
Glass culture tubes Fisher Scientific 14-961-26
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
20G needle BD B305175
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A
Screw cap cryotube ThermoFisher Scientific 379189
Nunc 15 mL conical tubes ThermoFisher Scientific 12-565-268
Gel loading tips Fisher Scientific 02-707-181
Millipore 0.2 µm spin filter Millipore Sigma UFC30GVNB
Low protein-binding Eppendorf tubes Eppendorf 22431081
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 Millipore Sigma 16101
27B10.4 antibody Cytoskeleton APY03-beads
Peptide assay kit Thermo Scientific 23275 Step 7
TopTip PolyLC Inc TT200TIO.96 Steps 5 and 9
SCX columns (PolySULFOETHYL A) PolyLC Inc SPESE1203
3 mL syringe BD 309657
Trifluoracetic Acid (TFA) Fisher Scientific PI-28904
Acetonitrile (ACN) Fisher Scientific A21-1
Lactic acid  Sigma-Aldrich 69785-250ML
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific A669S-500
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific BP510-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin, TPCK Treated Worthington Biochemicals LS003740
Lysyl Endopeptidase Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 125-05061
MonoTip PolyLC Inc TT200TIO.96 Step 10
ZipTip MilliporeSigma ZTC18S096 Step 6
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm Waters 186008794 Step 11: analytical column
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns ThermoFisher Scientific 164535 Step 11: trap column
Ultimate 3000 RLSCnano System Dionex ULTIM3000RSLCNANO Step 11
Q Exactive HF ThermoFisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBFZ Step 11
MilliQ water deionized water used to prepare all solutions and bufferes
Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 sonicator
Polytron System PT Kinematica AG PT 10-35 GT homogenizer

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References

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Cheng, L. C., Li, Z., Graeber, T. G., Graham, N. A., Drake, J. M. Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (138), e57996, doi:10.3791/57996 (2018).

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