Summary
Descreveremos um protocolo para a realização de um transplante no utero (IUT) através de vias intravenosa e intra-amniótica de injeção no modelo murino. Este protocolo pode ser usado para introduzir células, vetores virais e outras substâncias em único ambiente fetal imune-tolerantes.
Abstract
Transplante de in utero (IUT) é um modo único e versátil de terapia que pode ser usado para introduzir células-tronco, vetores virais ou quaisquer outras substâncias no início da gestação. A lógica por trás de IUT para fins terapêuticos baseia-se o pequeno tamanho do feto, a imaturidade imunológica fetal, a acessibilidade e natureza proliferativa de células estaminais ou progenitoras fetais e o potencial para tratar uma doença ou do início dos sintomas antes do nascimento. Aproveitando essas propriedades no desenvolvimento normais do feto, a entrega de células-tronco hematopoiéticas (HSC) através de uma IUT tem o potencial para tratar doenças hematológicas congénitas, tais como a doença falciforme, sem a necessária transplantes de mieloablativo ou imunossupressora condicionamento necessário para HSC pós-natal. Da mesma forma, a acessibilidade de células progenitoras em múltiplos órgãos, durante o desenvolvimento potencialmente permite um direcionamento mais eficiente de células tronco/progenitoras seguindo uma IUT de vetores virais para terapia do gene ou genoma de edição. Além disso, IUT pode ser usado para estudar os processos normais de desenvolvimento incluindo, mas não se limitando a, o desenvolvimento da tolerância imunológica. O modelo murino fornece um meio valioso e acessível para entender o potencial e as limitações da IUT antes da pré-clínicos estudos animais grandes e uma eventual aplicação clínica. Aqui, descrevemos um protocolo para a realização de uma IUT no feto através de vias intravenosa e intra-amniótica murino. Este protocolo tem sido usado com sucesso para elucidar as condições necessárias e mecanismos subjacentes no utero o transplante de células-tronco hematopoiéticas, indução de tolerância e no utero terapia de gene.
Introduction
Recentes avanços no diagnóstico e rastreio pré-natal tem trazido à luz da possibilidade de tratar o feto para um número de doenças congênitas que não tem as opções de tratamento pós-natal adequada e resultar em significativa morbidade e mortalidade. Especificamente, no utero o transplante de células-tronco hematopoiéticas (IUHCT) e edição de terapia/genoma gene têm potencial para tirar proveito das propriedades do desenvolvimento normais do feto para tratar doenças congênitas hematológica, imune e genética os transtornos mais eficientemente do que o transplante de HSC pós-natal e edição de genoma/terapia do gene podem fazer1,2. Especificamente, devido ao pequeno tamanho do feto, a célula do doador ou dose de vetor viral pode ser maximizado pelo peso do destinatário. Além disso, a imaturidade imunológica do feto permite doadores de linfócitos deve ser injetado sem a mieloablativo e imunossupressoras condicionamento que é exigido nos protocolos de transplante pós-natal. Da mesma forma, carregando um transgene terapêutico ou tecnologia de edição de genoma de vetores virais podem ser injetados sem uma resposta imune limitante para o transgene produto ou o vetor viral. Finalmente, a acessibilidade e a natureza proliferativa de células tronco/progenitoras fetais pagar a possibilidade de uma mais eficiente transdução de células progenitoras de destino, bem como certos modos de genoma edição (dirigido por homologia reparação) que necessitam de ciclismo células ocorra de forma eficiente. O modelo murino serve como um meio perspicaz e acessível para abordar questões importantes em biologia de células-tronco e Imunologia antes de fazer experiências em modelos pré-clínicos de animais grandes e, como tal, tem servido como o modelo principal em que IUHCT e no útero terapia genética têm sido exploradas1,2,3.
Apesar de muitas variáveis desempenham um papel importante no sucesso de IUHCT e no utero gene terapia/genoma edição em modelos animais murino e grandes, uma variável-chave é o método de entrega dos linfócitos ou vetor viral. A entrega de grandes doses de linfócitos de doadores com um efeito de primeira passagem ocorra no fígado fetal, o órgão hematopoiético aquando do IUHCT, foi mostrada para ser instrumental na obtenção de níveis de macrochimeric de enxertia em mouse e modelos animais grandes4 ,5. Isto foi conseguido através de uma injeção de doador células através da veia vitelínico no modelo de rato e através de uma injeção intra cardíaca no modelo canino. A rota de injeção também desempenha um papel fundamental no direcionamento de células progenitoras de órgãos diferentes durante o desenvolvimento. Por exemplo, uma injeção intravenosa através da veia vitelínico tem demonstrada eficientemente transduce cardiomyocytes e hepatócitos após um final de gestação injeção6,7. Alternativamente, uma injeção intra-amniótica de vetores virais permite a segmentação dos órgãos que estão expostos fisicamente baseados no dobradura/desenvolvimento embrionário no momento da injeção8. Isto é melhor exemplificado pela segmentação do epitélio respiratório através de uma injeção intra-amniótica no final da gestação para aproveitar normal "respirar" movimentos fetais, que expõe o trato respiratório para o vetor viral no amniótico fluido de9. Estes dois modos de IUT, por via venosa através da veia vitelínico e intra-amniótica, foram a base para várias experiências passadas e em curso no nosso laboratório. Neste protocolo, descrevemos em detalhe os métodos para a realização de IUT intravenosa e intra-amniótica no modelo murino.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso no Hospital de Filadélfia infantil e institucional Cuidado Animal.
1. criação de pipetas de injeção
- Usando um extrator vertical micropipeta, puxe uma pipeta conta de 100 µ l (Fig. 1A - 1C). Calibre o extrator micropipeta para que a extremidade pontiaguda é > 1 cm de comprimento.
Nota: Inicialmente, as configurações do extrator devem ser ajustadas para um comprimento ideal. Um ajuste de calor maior fará com que a ponta mais longa, e um ajuste de tração maior fará com que o diâmetro da ponta mais estreita. - Corte a extremidade pontiaguda para que ele seja ≥ 1 cm de comprimento. Certifique-se que o diâmetro interno na ponta da agulha está entre 70 µm e 100 µm e é inversamente proporcional ao comprimento da extremidade afilada.
Nota: O diâmetro interno também depende da calibração do extrator a micropipeta. Consulte as instruções do fabricante do puxador vertical micropipeta ou qualquer tipo de extrator de micropipeta preferencial. - Depois de se assegurar que a agulha tem o diâmetro interno correto, crie o chanfro de 15 a 20 graus por afiar a ponta usando um chanfrador micropipeta com um diamante afiar roda (Fig. 2A - 2C). Certifique-se de descansar a ponta suavemente sobre a roda sem muita pressão, para diminuir as chances de quebrar ou rachar a ponta.
Nota: Um pincel pode ser usado para limpar quaisquer resíduos que se acumula na ponta da agulha. - Avaliar a ponta sob um microscópio e certifique-se de que a ponta é redonda sem fichas ou rachaduras. Reavalie o diâmetro interno para certificar-se que é entre 70 µm e 100 µm (Figura 2D - 2 H).
- Desenhar linhas sobre o resto da agulha para designar a 5 µ l de volume entre elas (p. ex., agulhas com um diâmetro interno de 1,3 mm devem ter linhas desenhadas em incrementos de 3,77 mm).
- Autoclave a prévia de agulhas para uso em cirurgia e tratá-los com luvas estéreis.
2. injeções no utero
- Preparar os necessários instrumentos em autoclave-los antes do tempo. Incluem os instrumentos essenciais, tais como o suporte da agulha de microinjector, um motorista de agulha cirúrgica, um par de pinças Adson, um par de tesouras curvas regulares de tecido, uma seringa de insulina 1 mL, um par de aplicadores de ponta de algodão, uma pipeta de transferência, um tubo cónico de 50 mL e um pacote de sutura de Poliglactina 910 4-0.
- Usando uma técnica estéril, fixar o suporte da agulha a agulha e conecte-a microinjector.
Nota: As configurações do nitrogênio comprimido usado são como se segue: injetar 4-6 libras por polegada quadrada, contrapeso 0 psi. Dependendo do que está sendo injetado, especificamente, a viscosidade do injectate, bem como o tamanho da micropipeta, os tempos de injeção variam entre 0,3 - 1,5 s. - Limpe a ponta da agulha de todos os possíveis restos pela elaboração de 5-10 µ l de estéril 1x tampão fosfato salino (PBS) e em seguida limpando. Repita este x 2-3.
- Prepare grávidos ratos fêmeas de 2 a 6 meses de idade para a cirurgia de corte seus abdomens com uma tesoura. Tenha cuidado para não danificar os mamilos. Administre analgésicos orais (por exemplo, 100 µ l de 1,5 mg/mL suspensão oral de meloxicam por rato).
- Começa a encher a agulha com o material desejado (células/vetor/drogas) com o volume desejado. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da agulha enquanto abastecia a agulha.
Nota: O volume de injeção por feto varia de acordo com o delineamento específico. 20 µ l funciona bem para injetar um grande número de células (ou seja, até 107 células na veia vitelínico. Por exemplo, nós entregamos a 1 x 107 toda medula óssea células isoladas de C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 verde fluorescente da proteína (GFP)"] ratos através da veia vitelínico em fetos de Balb/c-14 dia gestacional. Para injeções de vetor viral, uma única injeção de 10 µ l de um vetor diluído 1:1 com PBS funciona bem. - Para calibrar o tempo de injeção, siga os seguintes passos.
- Empurre o modo botão x 3 sobre o microinjector para ir a tela de calibração de injeção. Ajustar o tempo de injeção, adicionando a intervalos de 10 ou 100 ms e empurrar o modo botão 2x.
- Aperte o botão de equilíbrio e empurrar o pedal uma vez. Agora empurre o pedal novamente e avaliar como muito volume é esvaziada fora a agulha por impulso. Se não calibrada para o volume desejado de 5-20 µ l por pedal impulso, repita as etapas 2.6.1 e 2.6.2.
Nota: Em geral, é bom calibrar cada impulso para entregar metade do volume total do destino de cada vez. Enquanto é possível injetar mais de 30 µ l ou mesmo 40 µ l de volume total, não geralmente vamos ao longo de 20 µ l por feto, por via venosa ou intra-amniótica.
- Preencha a agulha até o nível desejado.
- Começa a oferecer anestesia para o mouse, ajustando o medidor de fluxo de oxigênio para 1 L/min e o vaporizador de isoflurano para 3%.
- Confirme se o mouse é anestesiado, verificando a ausência do pedal reflexo. Transferi o mouse para uma almofada de aquecimento em uma posição supina.
- Aplica gel lubrificante de olho para evitar a dessecação da córnea. Prenda o mouse no lugar gravando os membros superiores e inferiores à almofada.
- Prepare o abdômen com clorexidina esfoliação, seguida de álcool e injetar um anestésico local (por exemplo, 100 µ l de bupivacaína 0,25%) por via subcutânea(Figura 3).
- Com uma tesoura, faça uma incisão de pele de 1-2 cm para que a borda inferior não é mais do que 1 cm para o introitus; a fáscia por baixo é muito fina e translúcida.
- Identifica a linha média da fáscia que é mais transparente do que a área circundante. Tenha cuidado para não machucar os navios epigástrico que se encontram em ambos os lados da linha média. Os navios epigástrico devem ficar feridos, mantenha a pressão com aplicadores de ponta de algodão para estancar o sangue.
- Usando a pinça Adson, belisque a fáscia sem pegar qualquer um dos órgãos como o intestino, bexiga ou fetos subjacentes. Abra a fáscia com tesouras, tomando cuidado para não danificar qualquer um dos órgãos. Uma vez em segurança, no abdômen, estender a incisão fascial. Torná-lo não é mais do que a incisão da pele.
- Use aplicadores de ponta de algodão para mover os intestinos para a parte superior do abdômen, expondo assim o útero gravid. Entrega o útero fora da incisão, cuidadosamente, identificando os ovários direito e esquerdos para garantir que todos os fetos são contados (Figura 3B).
- Coloque o útero esquerdo volta para o abdômen, de modo que apenas o útero certo é exposto; Isto impede a dessecação do útero e aquece os fetos não injectada.
- Segure a mais lateral feto/bolsa amniótica entre o polegar e o dedo indicador da mão não-dominante do operador (Figura 3C). Sempre seja gentil quanto não causa nenhum dano para os fetos.
- Posicione o microscópio de dissecação (uma ampliação de 10x é ideal) e ajustar o foco para que o feto está em exibição. Ajuste a iluminação para uma melhor visualização.
- Identificar a parte que será injectada (veia vitelínico, âmnio). Para injeções intravenosas, visualize tanto as veias vitelínico e suas anastomoses primeiro. Para injeções intra-amniótica, Oriente o feto com o lado direito no modo de exibição.
- Alcançar o espaço do alvo com a agulha, conforme descrito abaixo.
- Para uma injeção intravenosa, proceda como a seguir.
- Girar o útero para que a veia vitelínico que está sendo injectada é paralela à ponta da agulha; tenha em mente que as injeções devem ser feitas para a anastomose das duas veias.
- Colocar a agulha sobre o útero em um ângulo de 5° e perfurar a parede uterina. Agora que a dica é entre a parede uterina e o saco amniótico, coloque a ponta diretamente em cima da veia vitelínico.
- Em um ângulo quase tangencial, deslizar a agulha sobre a veia até o bisel perfura e avança para o recipiente; Isto é evidente por um flash de sangue visto na ponta da agulha (Figura 3-D).
Nota: Acessar a veia pode levar algumas tentativas, como a agulha não pode perfurar a veia com o primeiro deslize sobre a veia.
- Para uma injeção intra-amniótica, proceda como a seguir.
- Rode o saco amniótico e encontrar um local desprovido de vasos para perfurar.
- Aponte a agulha perpendicular à parede uterina e perfurar o útero, o saco vitelino e em seguida o saco amniótico. Tenha cuidado para não perfurar qualquer tecido fetal. Certifique-se que a agulha se passou entre os membros como isto confirma que a agulha está no saco amniótico. Então prosseguir com a injeção.
- Para uma injeção intravenosa, proceda como a seguir.
- Injete o volume apropriado de material desejado (normalmente 10-20 µ l) pressionando o pedal.
Nota: Porque o injector deve manter a visualização da ponta da agulha através do microscópio em todos os momentos, uma segunda pessoa deve ler as marcas da agulha para quantificar a quantidade injetada e informar o injector como muito volume é deixada para injetar. Uma discussão antes da injeção entre o injetor e o assistente é importante para evitar qualquer confusão e atraso. Isto é especialmente importante para injeções intravenosas, porque uma posterior remoção da agulha permitirá um refluxo de sangue venoso para o agulha e o resultado em uma dosagem imprecisa. - Retire a agulha do local da injeção, uma vez que o volume desejado é entregue. Como pode haver algum sangramento do navio punção site com injeções intravenosas, mantenha a pressão com o lado da agulha para 10-15 s para parar o sangramento.
- Prossiga para o próximo feto. Continue até que todos os fetos do corno uterino direito foram injetados.
- Retirar o corno uterino esquerdo do abdome e substituir o corno uterino bem para dentro da cavidade peritoneal.
Nota: Ocasionalmente, a agulha deve ser recarregado com o injectant. - Uma vez que todos os fetos foram injetados, substitua o útero no abdômen (Figura 3E). Certifique-se de evitar a Volvo uterina ou intestinal.
- Com uma pipeta de transferência descartável, coloque aproximadamente 2 mL de 1X PBS no abdômen para substituir quaisquer perdas insensíveis.
- Feche a fáscia e o abdômen em uma camada contínua usando as de 910 suturas Poliglactina 4-0 para evitar ferir os órgãos subjacentes durante o encerramento (Figura 3F - 3G).
- Remova a fita e transferir o mouse para uma gaiola debaixo de uma lâmpada de calor. Tenha cuidado para não colocar a lâmpada de calor demasiado perto para o mouse. Certifique-se que a gaiola tem roupa de cama, comida e água.
Nota: Também pode ser utilizada uma câmara quente controlada termostaticamente. O rato está acordado quando está ereto e ambulante. - Observar o mouse diariamente e dar a medicação para a dor, conforme necessário.
Nota: Nós rotineiramente dar meloxicam no pós-operatório dias 1 e 2 e às vezes no dia 3 se o mouse mostra sinais de dor. - Se fazer uma cirurgia de lote com o mesmo material de injeção, limpe a agulha de injeção com PBS estéril. Se injetar com um material diferente, descarte a agulha em um recipiente de objectos cortantes e usar uma agulha nova.
Nota: Recomendamos que promover os filhotes com mães portadoras imediatamente após o nascimento, caso a barragem monta uma resposta imune aos anticorpos injectant e transferências para o filhotes através do leite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sobrevivência e enxertia são importantes medidas de sucesso para experimentos IUHCT. Consoante os pontos de extremidade específicos de um experimento, fetos que receberam um IUHCT podem ser analisados pré-natal por uma cesariana ou pós-natal. Em média, as taxas de sobrevivência após injeções intravenosas variam de 75 a 100%. As taxas de sobrevivência após injeções intra-amniótica tendem a mais sorte do que injeções intravenosas, cerca de 85-100%.
Em nosso laboratório, o processo de treinamento para alcançar proficiência nestas técnicas leva cerca de 8 a 12 meses. Para avaliar a aquisição das competências necessárias para realizar estas injeções de forma reprodutível, estagiários são monitorados para enxertia de célula fetal da sobrevivência e doador em pontos de curto período de tempo após o IUT. Isso é demonstrado pelas seguintes experiências de controle de qualidade. Especificamente, 1 x 107 toda medula óssea células são isoladas C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ("GFP B6") ratos como anteriormente descrito5 e são injetados via veia vitelínico em fetos de Balb/c-14 dia gestacional. Em um grupo, o IUT foi realizado por um instrutor experiente e em outro grupo por um estagiário que tem praticado a técnica para ~ 4 meses. Imagens de microscopia fluorescente representativa de fígados fetais colhidos 24 h após o IUT são mostradas na Figura 4. Os fígados dos fetos que receberam o IUT pelo estagiário fluorescem menos devido a uma menor enxertia das células GFP transplantadas. Esses fígados foram então analisados por células de doador GFP+ por citometria de fluxo para quantificar os níveis de enxertia. A diferença de níveis de enxertia média entre os dois injectores correlaciona-se com as imagens que vi sob microscopia fluorescente (Figura 4B).
A capacidade de vetores virais entregues através da rota intra-amniótica para transduce células em contacto com o líquido amniótico é exemplificado a transdução de epiteliais células 48 h após a injeção intra-amniótica de Ad-GFP (um vetor de adenovírus carregando a GFP transgene10) em fetos de dia-12,5 gestacional (Figura 5A e 5B).
Figura 1 . O processo de fazer uma agulha de pipeta de vidro com o extrator de micropipeta. (A) montar a pipeta de vidro e prenda-a apertando os botões em cada extremidade do extrator. (B) quando segura, o interruptor de tração ativa o calor. As configurações mostradas são calor #1: 985 e Pull: 27. O vidro de tampa escuro deve ser fechado durante este processo para segurança. Foi aberto para fins de ensaio fotográfico. (C) a micropipeta é separado. Descartar a parte inferior e leve a parte superior da micropipeta separada para os próximos passos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . O processo de moagem a micropipeta para dar forma a ponta da agulha. (A), este painel mostra a configuração geral da moagem. Uma fonte de luz é necessário para visualizar a ponta ao microscópio. (B e C) montam a micropipeta em um ângulo de 15-20 °. (D) um acúmulo de detritos é esperado em todo o processo de moagem. Use um pincel para limpar a ponta para obter uma melhor visualização do processo de moagem. (E) A da ponta da agulha bem moído sem fichas identificáveis ou bordas irregulares é mostrada sob uma ampliação de 4x. (F, Ge H) Uma reinspecção da agulha chão sob uma ampliação de 10x mostra uma agulha bem moída com uma ponta afiada e suavizar as arestas em torno da ponta. Certifique-se de verificar a agulha em ângulos diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Transplante de laparotomia e no utero . (A) barbeado, anestesiar e uma barragem grávida de fita e preparar seu abdômen. (B) após a laparotomia, entregar a totalidade do útero fora do abdômen para a identificação de todos os fetos. (C) posição do feto com não-dominante o dedo indicador e polegar, mantendo a tensão com o terceiro dedo do cirurgião. Identifica a ponta da agulha ao microscópio em relação ao feto. (D), um flash de sangue fluindo de volta para a agulha de micropipeta deve ser visto mediante a canulação da veia vitelínico. (E) após uma conclusão de todas as injeções, coloque todos os fetos de volta para o abdômen. (F) fechar o abdômen com um única camada corrido usando suturas de polygalactin 910 4-0. (G) uma vez que o abdômen é totalmente fechado, deixe a barragem recuperar sob uma lâmpada de calor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Enxertia de células mononucleares de medula todo doador após uma injeção de veia vitelínico. (A) a diferença no grau de enxertia com (estagiário) e sem (instrutor) o vazamento das pilhas é mostrado claramente sob microscopia fluorescente. (B) por cento quimerismo reflecte-se também a mesma constatação mostrada pela análise de citometria de fluxo. Cada ponto de dados representa o fígado de um feto injetado diferente. A experiência foi realizada por um estagiário e um instrutor. As barras de erro representam um desvio padrão (SD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . O padrão de expressão da proteína verde fluorescente em um embrião fetal 48 h após a injeção intra-amniótica de Ad-GFP. (A), este painel mostra a córnea (seta vermelha) e a pele manchadas com as boas práticas agrícolas no E14.5 após a injeção intra-amniótica de Ad-GFP em E12.5 (E12.5/E14.5). (B), A cryosection da parte traseira do embrião (indicado com uma caixa de luz azul no painel um) em uma ampliação maior mostra que a transdução viral é limitada à camada superficial de células peridermal (setas vermelhas) e não a epiderme (epi). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
No útero o transplante é uma terapia potencial para muitas desordens congênitas que pode ser diagnosticada no início da gestação. O modelo murino de IUT permite que os pesquisadores para explorar o ambiente fetal ou para experimentar com diferentes terapias. Dependendo do que está sendo injetado e o que está sendo invadido, por via venosa ou intra-amniótica no utero transplante pode fornecer uma entrega confiável de um injectant para o espaço desejado.
Quando o direcionamento de determinados órgãos, é importante escolher a idade embriológica apropriada do feto, bem como a técnica de injeção. Enquanto a injeção intravenosa de células no E14 é ideal para o direcionamento do nicho hematológica, e a injeção intra-amniótica no E16 é ideal para o direcionamento do pulmão, estas não são as únicas opções disponíveis. Por exemplo, injeções intra-amniótica podem ser executadas para fetos tão cedo quanto E8 com ultra-som orientação8. Entrega sistêmica é também possível antes E14 com injeções intra cardíacas guiada por ultra-som em E9 - E1011. A viabilidade da realização de injeções em vários estágios de desenvolvimento do feto oferece grande potencial para experimentos para investigar a segurança e a eficiência de transferência do gene e transplantes de célula, bem como investigar as questões básicas de desenvolvimento Biologia.
Além disso, além de uma entrega por via venosa e intra-amniótica, outros sites também estão disponíveis para o direcionamento dependendo da finalidade da terapia ou a questão científica sendo perseguido. O no utero intramuscular abordagem tem sido usada para uma transferência de genes para distrofias musculares12, uma abordagem intraspinal para a transdução da medula espinhal neurônios motores13, e uma abordagem intracraniana para gene transfere-se para o alvo de doenças do sistema nervoso central14. Para transplante de células hematopoiéticas no utero , colestase e intraperitoneal rotas são adicionais opções viáveis como cada rota de entrega finalmente alveja o nicho hematopoiéticas15. No entanto, a via intravenosa transplante permite uma orientação mais eficiente das células de doadores para o nicho hematopoiética e uma dosagem maior de células do doador, resultando assim em geral maiores níveis de estável a longo prazo enxertia de célula doadora sem adicionado a mortalidade fetal1.
Os protocolos que temos detalhados acima para executar IUT é ferramentas poderosas e versáteis que permitem uma abordagem única no vivo estudando biologia de células-tronco e indução de tolerância imunológica, do desenvolvimento da imunologia, biologia do desenvolvimento, e edição de genoma/terapia genética pré-natal. Esses métodos de entrega também têm implicações clínicas relevantes e foram a base para estudos IUHCT e no útero da terapia do gene em pré-clínicos modelos animais grandes como os caninos e os ovinos modelo4,16. Eles vão continuar a servir como uma valiosa ferramenta para testar novas ideias em biologia do desenvolvimento e explorar novas terapias para devastadoras doenças genéticas, hematológicas, imunológica e metabólicas congênitas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
