セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ
Summary
細胞老化は、慢性加齢病理の発症における重要な因子である。老化細胞を標的とする治療薬の同定は、健康な老化を延長する約束を示す。ここでは、単一細胞における老化関連β-ガラクトシダーゼ活性の測定に基づくセノセラピューティクスの同定をスクリーニングするための新規アッセイを提示する。
Abstract
細胞老化は、健康寿命に悪影響を及ぼすと知られている老化の特徴の一つである。細胞培養において特異的に老化細胞を殺すことができる薬物は、セノリティックと呼ばくことができ、生体内の老化細胞の負担を軽減し、健康寿命を延ばすことができる。HSP90阻害剤、Bcl-2ファミリー阻害剤、ピペロングミン、FOXO4阻害ペプチドおよびダサチニブ/ケルセチンの組み合わせを含む複数のクラスのセノリティックスが同定されている。増加したリソソームpHでのSA-β-Galの検出は、老化細胞の検出のための最良の特徴付きマーカーの一つである。蛍光基質C12 FDGを用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)活性のライブ細胞測定を、DNAインターカレートホエヒト色素を用いて全細胞数の決定と組み合わせることで、その可能性を開く。老化細胞の死化(セノリティクス)またはSA-β-Galおよび他の発せ子細胞(セノモルフィック)の他の現象を抑制することによって、全体的なSA-β-Gal活性を低下させるセノセラピューティクス薬のスクリーン。高含有量の蛍光画像取得および分析プラットフォームを使用することで、SA-β-Gal、細胞形態および細胞数に対する影響に対する薬物ライブラリーの迅速かつ高スループットスクリーニングが可能になります。
Introduction
細胞老化はレナード・ヘイフリックとポール・ムーアヘッドによって初めて説明され、正常細胞は培養1で増殖する能力が限られていることを示した。老化細胞は、栄養素、成長因子および接触阻害の欠如にもかかわらず増殖に失敗するが、代謝活性2のままである。この現象は複製性老化として知られており、主にテロメア短縮に起因し、少なくともヒト細胞3で起こった。さらなる研究は、細胞が発癌性ストレス(腫瘍遺伝子誘発老化、OIS)、DNA損傷、細胞傷害薬、または照射(ストレス誘発老化、SIS)などの他の刺激に応答して老化を受けるように誘導できることを示しています4,5,6.テロメア浸食を含むDNA損傷に対応して、細胞は老化、制御されていない細胞増殖を開始するか、損傷を修復できない場合はアポトーシスを受ける。この場合、細胞老化は腫瘍抑制的な方法2で作用するとして有益であると思われる。対照的に、老化はDNA損傷を含む細胞損傷の蓄積による老化と共に増加する。老化細胞はサイトカイン、メタロプロテイナーゼおよび成長因子を分泌することができるので、老化関連分泌表現型(SASP)と呼ばれる、この加齢依存性の増加は、細胞老化およびSASPの減少した組織恒常性に寄与し、その後、老化。また、老化負担のこの年齢依存的な増加は、代謝疾患、ストレス感受性、プロジェリア症候群、および治癒障害7、8を誘発することが知られており、部分的には、多数の加齢関連の原因であるアテローム性動脈硬化症、変形性関節症、筋変性症、潰瘍形成、およびアルツハイマー病9、10、11、12、13などの疾患。老化細胞を排除することは、組織機能不全を予防または遅延させ、健康寿命を延ばすのに役立ちます14.これは、トランスジェニックマウスモデル14、15、16だけでなく、薬物スクリーニングの努力とバイオインフォマティクス分析の両方を通じて発見されたセノリティック薬と薬物の組み合わせを使用して示されています。老化細胞17、18、19、20、21、22で特異的に誘導される経路。より最適なセノセラピューティクス薬を同定することは、老化細胞の負担をより効果的に軽減することができ、健康な老化のための治療アプローチの開発における重要な次のステップである。
老化細胞は、培養と生体内の両方で特徴的な色分性および分子的特徴を示す。これらの老化マーカーは、老化誘導の原因または結果またはこれらの細胞における分子変化の副産物である可能性がある。しかし、老化細胞では特異的に単一のマーカーは見つからない。現在、老化関連β-ガラクトーシダーゼ(SA-β-Gal)検出は、インビトロおよびインビボで老化を測定する最良の特徴付けおよび確立された単一細胞ベースの方法の1つである。SA-β-Galは、pH4で最適な酵素活性を有するリソソームヒドロラーゼである。老化細胞がリソソーム活性23、24の増加を示すので、pH6での活性の測定が可能である。生細胞の場合、増加したリソソームpHは、バクオールH+-ATPase阻害剤バフィロマイシンA1または内染染酸性化阻害剤クロロキン25、26を用いてリソソームアルカリ化によって得られる。5-ドデカノイラミノフレッセインDi-β-D-ガラクトピラノシド(C12FDG)は、その12炭素親油性部分25に起因する細胞内のク破物を保持するように生細胞の基質として使用される。重要なことに、SA-β-Gal活性自体は老化細胞で同定された経路と直接接続されず、老化を誘発する必要はない。このアッセイにより、老化細胞は、高齢者の皮膚生検などの異種細胞集団や老化組織においても同定することができる。また、いくつかの生物および条件27、28、29における老化細胞検出のための信頼できるマーカーであるとして、細胞老化と老化23との間の相関関係を示すために使用されている。 30.ここでは、強い酸化ストレス誘発細胞老化を有する一次マウス胚線維芽細胞(MEF)を用いた蛍光基質C12 FDGに基づく高スループットSA-β-Galスクリーニングアッセイとその長所と短所について説明する。が議論されています。このアッセイは、異なる細胞型で行うことができるが、Ercc1-欠乏、DNA修復障害MEFの使用は、酸化ストレスの条件下で老化のより迅速な誘導を可能にする。マウスでは、DNA修復エンドヌクレアーゼERCC1-XPFの発現の低下は、DNA修復の障害を引き起こし、内因性DNA損傷の蓄積の加速、ROSの上昇、ミトコンドリア機能障害、老化細胞負荷の増加、幹細胞機能の喪失および早期老化, 自然老化に似ています31,32.同様に、Ercc1-欠乏MEFは、培養17でより急速に老化を受ける。老化MEFアッセイの重要な特徴は、各ウェルが老化細胞と非老化細胞の混合物を有し、老化細胞特異的効果の明確なデモンストレーションを可能にすることである。しかし、一次細胞における酸化ストレスを利用して老化を誘発することはより生理学的であると考えていますが、このアッセイは、エトポシドや照射などのDNA損傷剤で老化が誘導される細胞株にも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-β-Galは、Dimriらによって最初に発見された細胞老化のための明確に定義されたバイオマーカーである。(1995)老化したヒト線維芽細胞が増殖細胞と比較してpH623でアッセイした場合のSA-β-Galの活性を増加させたことを示す。一方、SA-β-Galに対するインビトロおよびインビボアッセイは、異なる細胞型および組織25、39、40に対して確立されている。<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金AG043376(プロジェクト2とコアA、PDR;プロジェクト1とコアB、LJN)およびAG056278(プロジェクト3とコアA、PDR、プロジェクト2、LJN)とグレン財団(LJN)からの助成金。
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
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