СА-З-Галактозидаза на основе скрининга Анализ для выявления senotherapeutic наркотиков
Summary
Клеточная чувствительность является ключевым фактором в развитии хронических возрастных патологий. Идентификация терапевтических средств, которые нацелены на старческие клетки, показывает перспективу для расширения здорового старения. Здесь мы представляем новый ассс для проверки для выявления сенотерапии на основе измерения сенесценции, связанной с активностью в одиночных клетках.
Abstract
Чувствительность клеток является одной из отличительных черт старения, как известно, негативно влияет на здоровую продолжительность жизни. Препараты, способные убивать старческие клетки специально в клеточной культуре, называют сенолитикой, могут уменьшить бремя старнейки клеток in vivo и расширить продолжительность жизни. На сегодняшний день выявлено несколько классов сенолитики, включая ингибиторы HSP90, ингибиторы семейства Bcl-2, пиперлонгумин, пептид ингибитор FOXO4 и сочетание дасатиниба/кверцетина. Обнаружение SA–з-Gal при повышенном лисосомальном рН является одним из наиболее характерных маркеров для обнаружения старческих клеток. Измерения живых клеток, связанных с сенесценцией, ассоциированной активностью (SA-q-Gal) с использованием флуоресцентного субстрата C12FDG в сочетании с определением общего числа клеток с помощью ДНК, интеркалирующей краситель Hoechst, открывает возможность экран для сенотерапевтических препаратов, которые либо уменьшают общую активность SA-и-Gal путем уничтожения старческих клеток (сенолитики) или путем подавления SA-и-Gal и других фенотипов старческих клеток (сеноморфики). Использование платформы для приобретения и анализа высокой содержания флуоресцентных изображений позволяет быстро, высокой пропускной проверки библиотек лекарственных средств для воздействия на SA-и-Gal, морфологию клеток и номер клеток.
Introduction
Сотовый сенесценции был описан в первый раз Леонард Хейфлик и Пол Мурхед, который показал, что нормальные клетки имели ограниченную способность размножаться в культуре1. Чувствительные клетки не размножаться, несмотря на наличие питательных веществ, факторы роста и отсутствие ингибирования контакта, но остаются метаболически активными2. Это явление известно как репликативное сенесценции и в основном связано с сокращением теломер, по крайней мере в клетках человека3. Дальнейшие исследования показали, что клетки также могут подвергаться сенесценции в ответ на другие стимулы, такие как онкогенный стресс (онкоген индуцированный сенесценции, ОИС), повреждение ДНК, цитотоксические препараты, или облучение (стресс индуцированного сенесценции, SIS)4 , 5 , 6. В ответ на повреждение ДНК, в том числе эрозии теломер, клетки либо senesce, начать неконтролируемый рост клеток, или пройти апоптоз, если повреждение не может быть восстановлена. В этом случае, ценение клеток, кажется, полезно, как он действует в опухоли подавляет образом2. В отличие от этого, сенесценция увеличивается со старением из-за накопления повреждения клеток, включая повреждение ДНК. Так как старческие клетки могут выделять цитокины, металлопротеины и факторы роста, называемые сенесценции связанных секреторный фенотип (SASP), это возрастно-зависимое увеличение клеточного сенесценции и SASP способствует снижению ткани гомеостаза и впоследствии старения. Кроме того, это возрастно-зависимое увеличение бремени старения, как известно, вызывают метаболические заболевания, чувствительность к стрессу, синдромы прогерии, и нарушение исцеления7,8 и, в частности, отвечает за многочисленные возрастные заболеваний, таких как атеросклероз, остеоартрит, мышечная дегенерация, образование язвы, и болезнь Альцгеймера9,10,11,12,13. Устранение старческих клеток может помочь предотвратить или отсрочить дисфункцию тканей и продлить healthspan14. Это было показано в трансгенных моделях мыши14,15,16, а также с помощью сеноличных препаратов и комбинаций лекарств, которые были обнаружены как с помощью усилий по скринингу наркотиков и биоинформатический анализ пути, индуцированные специально в старческих клетках17,18,19,20,21,22. Выявление более оптимальных сенотерапевтических препаратов, способных более эффективно снизить бремя старческих клеток, является важным следующим шагом в развитии терапевтических подходов к здоровому старению.
Чувствительные клетки имеют характерные фенотипические и молекулярные особенности, как в культуре, так и в vivo. Эти маркеры сенесценции могут быть либо причиной, либо результатом индукции сенесценции, либо побочным продуктом молекулярных изменений в этих клетках. Тем не менее, ни один маркер не найден конкретно в старческих клетках. В настоящее время, сенесценция связанных й-galactosidase (SA-я-Гал) обнаружение является одним из наиболее характерных и установленных одноклеточных методов для измерения сенесценции в пробирке и in vivo. СА-З-Гал – это лизосомальная гидролаза с оптимальной ферментативной активностью при рН 4. Измерение его активности при рН 6 возможно, потому что старческие клетки показывают повышенную лисосомальную активность23,24. Для живых клеток, увеличение лизосомального рН получается путем лизосомальной щелочной с вакуолярной H -ATPase ингибитор Bafilomycin A1 или эндосомальный ингибификатор подкисления хлорохин25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Ди-з-D-galactopyranoside (C12FDG) используется в качестве субстрата в живых клетках, как он сохраняет расщепляние продукта в клетках из-за его 12 углеродных липофильных moiety25. Важно отметить, что сама деятельность SA-q-Gal не связана напрямую с каким-либо путем, выявленным в старческих клетках, и не является необходимой для того, чтобы вызвать сенесценцию. С помощью этого отзыва, старческие клетки могут быть определены даже в неоднородных популяций клеток и старения тканей, таких как биопсии кожи от пожилых людей. Он также был использован, чтобы показать корреляцию между старением клеток и старения23, как это надежный маркер для обнаружения старческих клеток в нескольких организмах и условиях27,28,29, 30. Здесь описывается скрининговый анализ с высокой пропускной результатом SA-‘-Gal, основанный на флуоресцентном субстрате C12FDG с использованием первичных эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) с надежно окислительным стрессом, индуцированным клеточным сенесценцией, и описаны его преимущества и недостатки обсуждаются. Хотя этот анализ может быть выполнен с различными типами клеток, использование Ercc1-дефицит,ремонт ДНК нарушения MEFs позволяет более быстроиндукции сенесценции в условиях окислительного стресса. У мышей снижение экспрессии эндонуклеи реаниализа ДНК ERCC1-XPF вызывает нарушение репарации ДНК, ускоренное накопление эндогенных повреждений ДНК, повышенную ROS, митохондриальную дисфункцию, повышенную старческой клеточной нагрузки, потерю функции стволовых клеток и преждевременное старение, аналогично естественному старению31,32. Аналогичным образом, Ercc1-дефицитныеMEFs проходят сенесценцию быстрее в культуре17. Важной особенностью старческого игпромата meF является то, что каждая скважина имеет смесь старческих и нестареческих клеток, что позволяет четко проявлять старческие клеточные эффекты. Однако, хотя мы считаем, что использование окислительного стресса в первичных клетках, чтобы вызвать сенесценцию является более физиологическим, этот анализ также может быть использован с клеточными линиями, где сенесценция индуцируется с ДНК повреждающих агентов, таких как этопозид или облучение.
Protocol
Representative Results
Discussion
СА-З-Гал является четко определенным биомаркером клеточного сенесценции, первоначально обнаруженным Димри и др. (1995), показывающий, что старческие фибробласты человека имеют повышенную активность SA-и-Gal при оценке на рН 623 по сравнению с размножающимися клетками. Между…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH Grants AG043376 (Проект 2 и Ядро А, ДНР; Проект 1 и Core B, LJN) и AG056278 (Проект 3 и Ядро A, PDR; и Проект 2, LJN) и грант от Фонда Гленна (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
Referências
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -. C., Hu, M. -. L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo?. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
