Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Pluripotent kök hücre üretimi insan ilkel Germ hücreli benzeri hücre Embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotent adlı indüklenen

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

Primordial germ hücreleri (PGCs) ortak öncüleri sperm ve yumurta vardır. İnsan embriyonik PGCs pluripotent epiblast hücreleri sitokinler etkileşimleri aracılığıyla belirtilir. Burada, biz insan hücreleri transcriptomally embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotency indüklenen pluripotent kök hücreler, PGCs benzeyen inducing bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak.

Abstract

Primordial germ hücreleri (PGCs) germline hücrelerin tümünü ortak öncüleri vardır. Fare embriyo ~ 40 PGCs kurucu nüfusu sitokinler, kemik morfogenetik protein 4 (Bmp4) de dahil olmak üzere için orkestra Etkilenmeler tarafından pluripotent epiblast hücrelerinden indüklenen. İnsan embriyosu, en erken PGCs sarısı sac gebeliğin 3rd haftanın sonunda etrafında endodermal duvara tespit edilmiştir ama insan PGC belirtimi ve erken geliştirme süreci hakkında az şey bilinir. İnsan embriyonik PGCs okuyan teknik ve etik engelleri aşmak için vekil hücre kültür modelleri son zamanlarda pluripotent kök hücrelerden üretilmedi. Burada, biz insan PGC-Like hücre (hPGCLCs) sağlam üretim için bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) astarlanmalıdır pluripotency durumda tutulan orta 48 saat boyunca yeniden programlama 4i saf içinde inkübe, tek kişilik hücrelere ayrışmış ve microwells paketlenmiştir. Uzun süreli hiPSCs ve saf pluripotency Devlet bakımından önemli kromozom anomalileri neden olur ve kaçınılmalıdır. 24 saat içinde daha sonra formu embryoid organları (EBs), 4i ortamına düşük-bağlılık plasticware yüksek konsantrasyon içeren hPGCLC indüksiyon orta sallanan bir koşulda içinde kültürlü bir ek için hiPSCs microwells içinde korunur Rekombinant insan BMP4. EBs daha da hPGCLCs en yüksek verimi elde etmek için sallanan, Sigara yapışık durumda 8 güne kadar kültürlü. İmmünhistokimya, hPGCLCs kolayca güçlü OCT4 neredeyse tüm EBs içinde sadece onların yüzeyinde ifade hücreler olarak algılanır. EBs enzimatik ayrışmış ve FACS zenginleştirme için tabi hPGCLCs CD38 + % 40-45'e kadar hücrelerle olarak toplanabilir verim.

Introduction

Primordial germ hücreleri (PGCs) her iki cinsiyette bütün germline hücrelerinin ortak öncüleri vardır. Çoğu memeli embriyo PGCs gelişiminde bizim bilgi, elde laboratuvar fareler1,2eğitim yoluyla. Embriyonik gün fare embriyo 6.0-6.5, PGC öncüleri 6 veya benzeri az sayıda epiblast ve ~ 40 PGCs onlardan bir şekilde bağlı olarak kemik morfogenetik proteinler Bmp2 ve Bmp4 üzerinden bitişik salgılanan indüklenir kurucu nüfusu bulunmaktadır hücreleri. Sarısı sac gebelik3üçüncü haftanın sonunda etrafında endodermal duvarına erken insan PGCs defa embriyo tespit edildi. Çünkü bu aynı yerde geçirme PGCs fare embriyo gözlemlediği gibi gözlenen insan PGCs geçiş ama değil kurucu nüfus yolunda olduğunu muhtemeldir. Ancak, geri önceki aşamaları takip çalışmalar PGCs veya PGC kara filmin tarih öncesi insan embriyosu içinde eksik olmuştur.

İnsan embriyonik PGCs erişim etik ve teknik engeller nedeniyle meydan okuyor. Bu engelleri aşmak için PGC benzeri hücre kültür modelleri son zamanlarda insan pluripotent kök hücrelerden (PSC) üretilmedi. Pluripotent germline ve üç embriyonik mikrop katmanlar4ayırt etmek için hücresel yetenektir. Hücre dışı matriks proteini ile kaplı yemekleri mTeSR1 Orta (kullanıma hazır, piyasada bulunan Orta astarlanmalıdır pluripotency devlet insan PSC'ler bakımı için formüle edilmiş) insan PSC'ler saklanır, ancak astarlanmalıdır durumlu pluripotency var 4, 2013 yılında Jacob Hanna'nın laboratuar astarlanmalıdır pluripotent hücreler tarafından protein kinaz için kimyasal inhibitörleri içeren saf insan kök hücre Orta (NHSM) açığa ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, saf pluripotency durumuna dönüştürülebileceğini gösterdi p38 MAPK ve büyüme faktörleri LIF, TGF, bFGF5. Saf-pluripotency insan PSC'ler 2015 yılında Hanna ve Azim Surani liderliğindeki bir araştırma grubu insan PGC-Like hücreleri (hPGCLCs) PSC6ilk sağlam üretimi tamamlandı. Daha sonra bizimki de dahil olmak üzere birçok diğer laboratuvarlar, hPGCLCs biraz farklı protokolleri7,8,9,10kullanarak PSC'ler gelen nesil rapor. Bizim çalışma (ki bizim daha önce yayımlanmış çalışma10içinde tablo S1 özetlenmiştir) farklı protokolleri kullanılarak oluşturulan hPGCLCs transcriptomally birbirlerine10' a benzer olduğuna dair bir kanıt sağladı. Eldeki kanıtlar insan PGCLCs için küresel epigenetik silme7 ve/veya kemotaktik geçiş10önce aşamasındaki insan embriyonik PGCs benzerliğe destekler.

Çalışmaların fare embriyonik PGCs, fare PGCLCs ve insan PGCLCs (ama yalnızca insan PGCs çok sınırlı erişim) moleküler mekanizmaları PGC belirtiminin fare ve insan1,6, önemli ölçüde farklıdır ortaya koymuştur 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Örneğin, Prdm14 fare embriyo belirtiminde PGC kritik rol oynar, ama insan PGC belirtimi rolü sınırlı1,15görünüyor. Buna ek olarak, bu transkripsiyon faktörleri için fare PGC belirtimi15gereksiz görünüyor ise SOX17 EOMESODERMIN tarafından indüksiyon PGC belirtimi6,11,14için önemlidir. HPGCLCs güçlü kullanarak çalışmalar ilk bu başarılarının önemini bu hücre kültür model insan embriyonik PGCs bir vekil olarak destekler.

Bizim lab's derin sıralama genomik DNA kopyalama numara analizi, değerlendirilmesi ile ilgili kısa bir süre önce çalışmalar PSC'ler saf pluripotency durumda uzun süreli bakım önemli ölçüde kromozom istikrarsızlık riski artırır göstermiştir ve yapısal anomaliler. Bu olay hem fare18 ve insan19 PSC'ler gözlendi. Hanna/Surani tarafından bildirilen özgün hPGCLC üretim Protokolü insan PSC'ler 4i saf pluripotency orta için en az 2 hafta6muhafaza için geliştirilmiştir. Normal diploit karyotip insan PSC'ler ve PGCLCs korumak için biz hangi insan PSC'ler için bu makalede sunulan sadece 72 saat10, 4i orta maruz değiştirilmiş bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. İnsan iPSCs (hiPSCs) altında astarlanmalıdır pluripotency durumu korunur. Hemen EB oluşumu önce hücreleri 4i saf programlama Orta (değiştirilmiş NHSM orta) 48 saat inkübe. Hücreler sonra ayrışmış ve paketlenmiş forma EBs microwells 4i Orta içinde ek bir 24 saat. EBs rekombinant insan BMP4 8 gün için no-eki kültür için sallanan bir koşul altında hPGCLCs maksimum verim elde etmek için yüksek konsantrasyon içeren hPGCLC indüksiyon ortamda sürdürülür. CD38 + % ~ 40 hücrelerle FACS sıralanabilir tek hücre süspansiyon verim olarak 8 günlük EB kültür sonra hPGCLCs Disosiye EB hücrelerden FACS tarafından ayrılmış olabilir. Yayınlayan diğer ise bizim değişiklikler6önce özgün protokolü de dahil olmak üzere yöntemleri7,8,9, genellikle oluşturmak hPGCLCs içinde özel olmadan kendiliğinden oluşan hücre toplamları yerelleştirme, bizim iletişim kuralı tarafından üretilen hPGCLC embryoid organları (EBs) yüzeyde görülmektedir.

Protocol

1. hücre kültürü Primed Pluripotency devlet hiPSCs

  1. Hücre dışı matriks proteini kaplı yemeklerin hazırlanması
    1. Gecede Matrigel (hücre dışı matriks proteini) bir buzdolabı veya soğuk bir oda buz çözülme (Oda sıcaklığında veya sıcak su banyosu kullanarak çözülme değil). Aliquot matris protein (~ 200 μL; bir aliquot hacmi her toplu iş için üretici tarafından belirlenen ve şişenin etiketinde belirtilen) steril düşük-bind santrifüj tüpleri veya buz üzerine hücre dondurma boruları. Katılaşma önlemek için dağıtımı sırasında hücre dışı matriks proteini buz gibi tutmak önemlidir. Aliquots-80 ° C'de depolayın
    2. Hücre kültürü plastik yemekleri hücre dışı matriks proteini ile kat için bir aliquot ile 25 mL seyreltik buz gibi DMEM/F12 ve yayılmasına üç 10 cm yemekleri (~ 8 mL/çanak). Yemekler, oda sıcaklığında en az 1 saat kuluçkaya. Sonra kaplama, yemekler Parafilm kullanarak ve bir hafta kadar oda sıcaklığında saklanan kapalı gibi.
    3. Orta yemeklerin hemen önce aşı astarlanmalıdır pluripotency hiPSCs Aspire edin. Orta veya Kalsiyum/Magnezyum-Alerjik fosfat tamponlu tuz [PBS(-)] ile kaplı bulaşıkları yıkamak gerekli değildir.
  2. HiPSC kültür ve astarlanmalıdır pluripotency devlet inisiyasyon
    1. 2 µL [Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü] 50 mm Y27632 mTeSR1 ortamda 15 mL santrifüj tüpü 10 mL ekleyin. Hücre kültüründe bir 10 cm çanak 1 mL hücre hisse senedi donmuş üzerinden başlatmak için ROCK 10 mL inhibitörü takıma orta iki Tüp hazırlayın. Y27632-takıma orta aynı gün kullanın. Y27632-takıma orta 5 min için 37 ° C su banyosunda prewarm.
      Not: Bu protokolü de hiPSCs mTeSR1 içinde muhafaza ile çalışır. HiPSCs değişen insan PSC büyüme destekleyen diğer ortamlarda muhafaza derecelerde astarlanmalıdır veya saf pluripotency, hPGCLCs verimi önemli ölçüde değişebilir.
      Not: Tam mTeSR1 raf ömrü 4 ° C'de 2 hafta ve 6 ay-20 ° C, ancak yeniden donma nedenleri kötü performans değil. MTeSR1-20 ° C'de 40 mL aliquots kadar kullanmak dondur.
    2. Hisse senedi (1 mL dondurma orta 106 hücrelerde x 1.0-3.0) dondurulmuş astarlanmalıdır pluripotency hiPSC bir şişe çözülme 37 ° C su banyosu kullanarak. Çözdürme tamamlanmasından hemen sonra bir şişe tüm içeriğini prewarmed Y27632 takıma orta bir tüp (10 mL) içine aktarın.
    3. 8 dk. süpernatant atmak ve hücre Pelet 10 mL ile resuspend için diğer tüpünden santrifüj hücre süspansiyon, oda sıcaklığında, 300 x g Y27632 takıma prewarmed.
    4. Eşit hücre süspansiyon bir hücre dışı matriks proteini kaplı 10 cm çanak içine yayılmış. Çanak bir tri-gaz CO2 kuluçka makinesine (37 ° C, % 6.5 O2, % 5 CO2) yerleştirin. Düşük oksijen basınç altında hiPSC kültür korumak.
    5. Değişim Orta (mTeSR1 Y27632 olmadan) her gün. ROCK inhibitörü (Y27632) hemen sonra ayrılma tek hücrelere hiPSC hayatta kalmak için önemlidir. HiPSCs ile eşit olarak dağıtılmış küçük toplamları olarak hücre dışı matriks proteini kaplı yüzey üzerinde uygun bir kez > (ki genellikle aşı sonra 16 saat içinde tamamlanır) % 10 confluency Y27632 gereksiz. Y27632 olmadan Disosiye hiPSCs aşı sonra çok erken orta değiştirmek hemen hemen tam hücre ölümüne neden olabilir.
  3. Passaging pluripotency astarlanmalıdır hiPSCs
    Not: ne zaman koloniler işgal ~ %80 etkili büyüme çevrenin pluripotency hiPSCs geçiş astarlanmalıdır. Passaging prosedürler ve yoğunlukları deneysel tekrarlanabilirlik için önemli. Biz hPGCLC indüksiyon verimliliğini başlatma (bir ya da iki pasajlar içeren) donmuş bir hisse senedi veya bir ay sonra 6 gün hiPSC kültürler arasında önemli ölçüde farklı olmadığını gördük (içeren > 10 pasajlar). Her ne kadar verim değil nicelik değerlendirildi indüksiyon hPGCLC üzerinden iki ay için tutulan hiPSCs üzerinden başarıyla gerçekleştirildi.
    1. 4 mL hücre ayrılma enzim karışımı bir 15 mL santrifüj tüpü al ve oda sıcaklığında 5 min için için equilibrate.
    2. 15 mL santrifüj PBS(-) prewarm 10 mL tüp için > su banyosu içinde 37 ° C'de 5 dak.
    3. 2 µL (ROCK inhibitörü) 50 mm Y27632 15 mL santrifüj tüpü 10 mL mTeSR1 ortamda ekleyin. ROCK 10 mL inhibitörü takıma orta iki tüp hazırlamak ve aynı gün içinde kullanın. Başka bir 15 mL santrifüj tüpü, 5 mL mTeSR1 Y27632 eklemeden götürün. 5 min için 37 ° C su banyosunda prewarm orta + /-Y27632.
      Not: 1.3.3 adımda hazırlanan tüm Orta aliquots Y27632 içerebilir.
    4. Eski orta prewarmed 10 mL PBS(-) hemen ile 10 cm çanak ve durulama hücreleri Aspire edin. PBS(-) atın ve 4 mL ayrılma enzim yemek için ekleyin. CO2 kuluçka makinesine çanak yerleştirin (tri-Yakıt Ekstraktörü çalışır ama gerekli) ~ 4 hücre alt kısmından ayırmak kadar min için. Yavaşça damlalıklı hücreleri tek hücre süspansiyon yukarı ve aşağı yapmak.
    5. HiPSC tek hücreli süspansiyon (Toplam 15 mL tüp içinde yaklaşık 9 mL birimdir) Y27632 olmadan 5 mL orta içeren prewarmed tüp aktarın. Oda sıcaklığında, 300 x g 8 dk santrifüj hücre süspansiyon.
    6. Süpernatant atın ve hücre Pelet 10 mL Y27632 içeren prewarmed orta orta ile resuspend.
    7. 40-µm hücre süzgeç kullanarak hücre toplamları kaldırın ve hücre yoğunluğu Coulter sayaç belirlemek.
    8. Hücre süspansiyon ile 3.0 x bir hücre dışı matriks proteini kaplı 10 cm çanak aşılamak için 10 ml 106 hücre elde etmek için prewarmed Y27632 takıma orta sulandırmak. İnoculated çanak bir tri-gaz CO2 kuluçka makinesine (37 ° C, % 6.5 O2, % 5 CO2) yerleştirin.
    9. Değişim Orta (mTeSR1 Y27632 olmadan) her gün.

2. nesil hPGCLCs

Not: aşağıdaki adımları hiPSC hücreleri bir 10 cm tabak (mTeSR1 orta, hücre dışı matriks proteini kaplı) ~ %80 confluency (yaklaşık 107 hücreleri) ulaştığında başlatın.

  1. Hücre dışı matriks proteini kaplı yemekleri (gün 1) hazırlanması
    1. Bir aliquot hücre dışı matriks protein buz çözme ve buz gibi DMEM/F12 25 mL seyreltik.
    2. 6-iyi tabak (1 mL/de) seyreltilmiş hücre dışı matriks protein dağıtmak. Bir aliquot 24 wells (4 plakaları) kat yeterli olur. Tabaklar, oda sıcaklığında en az 1 saat kuluçkaya. Kullanılmayan kaplamalı plakalar mühürlü ve oda sıcaklığında bir hafta kadar saklanır.
    3. Tabak hemen önce astarlanmalıdır pluripotency hiPSCs aşılama ortamından Aspire edin. Orta veya PBS(-) ile kaplı bulaşıkları yıkamak gerekli değildir.
  2. Astarlanmalıdır pluripotency hiPSCs aşılama hücre dışı matriks proteini kaplı levhalar (gün 1) içine
    1. Hücre ayrılma enzim 4 mL bir 15 mL santrifüj tüpü al ve oda sıcaklığında 5 min için için equilibrate.
    2. 15 mL santrifüj PBS(-) prewarm 10 mL tüp için > su banyosu içinde 37 ° C'de 5 dak.
    3. 35 mL mTeSR1 orta 50 mL santrifüj tüpü içinde 7 µL 50 mm Y27632 (ROCK inhibitörü) ekleyin. Y27632-takıma orta aynı gün içinde kullanın. Toplam 70 mL Y27632 takıma orta için iki tüp yapmak ve 37 ° C su banyosu 15dk için ortamda prewarm.
    4. Eski orta prewarmed 10 mL PBS(-) hemen ile 10 cm çanak ve durulama hücreleri Aspire edin. PBS(-) atın ve 4 mL hücre ayrılma enzim yemek için ekleyin. CO2 kuluçka makinesine çanak yerleştirin (tri-Yakıt Ekstraktörü çalışır ama gerekli) ~ 4 hücre alt kısmından ayırmak kadar min için. Yavaşça damlalıklı hücreleri tek hücre süspansiyon yukarı ve aşağı yapmak.
    5. HiPSC tek hücreli süspansiyon 10 mL Y27632 takıma orta içeren prewarmed tüp aktarın. Oda sıcaklığında, 300 x g 8 dk santrifüj hücre süspansiyon.
    6. Süpernatant atın ve hücre Pelet 10 mL prewarmed Y27632 takıma orta ile resuspend.
    7. Hücre süspansiyon hücre toplamları kaldırmak ve Coulter sayaç hücreleri saymak için bir hücre süzgeç aracılığıyla (40 µm gözenek boyutu) filtre.
    8. HiPSC tek hücre süspansiyon 5.0 x 50 mL prewarmed Y27632 takıma orta 106 hücrelerde sulandırmak.
    9. 2 mL hücre süspansiyon (2.0 x 105 hücreleri) kaplamalı 6-şey plakaların (4 plakaları, 24 kuyu) her şey aşılamak. Hücreleri her kuyuya eşit şekilde dağıtılır emin olun. Hücre kültür plakaları bir tri-gaz CO2 kuluçka makinesine (37 ° C, % 6.5 O2, % 5 CO2) yerleştirin.
      Not: İnoculum hücre yoğunluğu ve hatta dağıtım her şey önemli. HiPSCs aşı içine 10 cm yemekler diğer alanlarda daha anlamlı olarak daha yüksek hücre yoğunluğu neden olabilir çünkü. Tek hücreli hiPSCs bile hücre yoğunluğu daha kolay 6-şey plakaları ile elde edilebilir.
    10. Az 24 saat sonra aşı Orta 2 mL/iyi mTeSR1 (olmadan Y27632) ile değiştirin.
  3. Dönüşüm astarlanmalıdır pluripotency devlet hiPSCs 4i-naif (ERK-bağımsız) pluripotent hücreler (gün 3 ve 4. gün)
    1. 4i tam saf pluripotency Orta (3. gün ve gün 4) aşağıdaki gibi bir 50 mL santrifüj tüpü hazırlayın: of 4i bazal orta 50 mL, 5 µL 30 mm CHIR99021, 10 mm PD0325901, 20 mm BIRB796, 50 mm SP600125 5 µL 5 µL 5 µL ve 50 mm Y27632 5 µL.
      Not:-80 ° C ve tezcan 4i bazal orta gece buzdolabında saklayın. Taze 4i tam orta kullanımdan hemen önce hazırlayın. Güçlü bir ışık (CHIR, PD, BIRB ve SP) 4i kimyasal maruz kaçının. 4i tam depolamayın 4 ° C'de orta veya donmuş gece veya daha uzun.
    2. Sıcak 50 mL 4i tam orta 37 ° C su toplu ile 15 dk. değişiklik ortam için 48 ila 72 saat sonra aşılama, 4i tam orta (2 mL/de) prewarmed. Orta değiştirmek tam zamanlaması yüksek hPGCLC verim ve deneysel tekrarlanabilirlik elde etmek önemlidir.
      Not: Yoğunluk 4i hiPSC kültürünün bu koşul altında yüksek ve 48-72 saat sonra aşı konfluent haline, ancak bu normaldir.
  4. Microwell levha (gün 5) kullanarak EB oluşumu
    1. 50 mL 50 mL santrifüj tüpü 4i tam ortamda hazırlamak ve ~ 15 dk kullanmadan önce bir 37 ° C su banyosunda prewarm.
    2. 35 mL DMEM/F12 50 mL santrifüj tüpü kullanmadan önce ~ 15 dk 37 ° C su banyosunda prewarm.
    3. Bir microwell tabak hazırlamak
      1. %5 (w/v) filtre sterilize Pluronic F-127 deterjan microwell plaka 8 etkin kuyu ekleyin ( Tablo reçetesi; bkz: 0.5 mL/iyi).
      2. Oda sıcaklığında 5 dk. kontrol microwells hava kabarcıkları yokluğu sağlamak için ters bir mikroskop ile 1000 x g microwell plaka santrifüj kapasitesi. Microwells deterjan ile kat için oda sıcaklığında 30 dk microwell plaka bırakın.
      3. Prewarmed DMEM/F12 ile pipetting ve durulama wells tarafından microwell plaka kuyulardan deterjan solüsyonu atmak (2 mL/de).
      4. Microwell plaka, oda sıcaklığında, 1000 x g 5 dk. kontrol microwells hava kabarcıkları yokluğu sağlamak için ters bir mikroskop ile santrifüj kapasitesi.
        Not: hava kabarcıkları microwells içinde hala gözlendiğinde, microwell levha hala sıkıca kuyunun altına yapıştırılmış olan inceleyin.
      5. DMEM/prewarmed DMEM/F12 ile F12 pipetting ve durulama wells tarafından microwell plaka kuyulardan atmak (2 mL/de).
      6. Adımları yineleyin 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. 4i tam orta microwell plaka (1 mL/de) durulanır kuyu ekleyin. Kalan 4i tam orta bir 37 ° C su banyosunda tutmak.
      8. Microwell plaka, oda sıcaklığında, 1000 x g 5 dk. kontrol microwells hava kabarcıkları yokluğu sağlamak için ters bir mikroskop ile santrifüj kapasitesi.
      9. Microwell plaka bir tri-gaz kuluçka (37 ° C, % 6.5 O2, % 5 CO2) 4i hiPSCs aşılama kadar yerleştirin.
    4. Microwell plaka içine of 4i iPSCs aşı
      1. Hücre ayrılma enzim 13 mL bir 15 mL santrifüj tüpü al ve oda sıcaklığında 5 min için için equilibrate.
      2. 50 mL santrifüj PBS(-) prewarm 50 mL tüp için > su banyosu içinde 37 ° C'de 5 dak.
      3. Saf hiPSC hücre kültür ve durulama hücre prewarmed 2 mL ile bir kez 24 kuyulardan eski orta Aspire edin/PBS(-) iyi. PBS(-) atmak ve 0.5 mL/iyi ayrılma enzim ekleyin. Hücre alt kısmından ayırmak kadar ~ 4 min için CO2 kuluçka (37 ° C) hücre kültür tabak koyun. Yavaşça damlalıklı hücreleri tek hücre süspansiyon yukarı ve aşağı yapmak.
      4. HiPSC tek hücreli süspansiyon prewarmed 20 mL 4i tam orta olarak aktarın. Oda sıcaklığında, 300 x g 8 dk santrifüj hücre süspansiyon.
      5. Süpernatant atın ve hücre Pelet 5 mL prewarmed 4i tam orta ile resuspend.
      6. Hücre süspansiyon hücre toplamları kaldırmak için bir hücre süzgeç aracılığıyla (40 µm gözenek boyutu) filtre. Hücre süzgeç 3 kez 1 mL prewarmed 4i tam orta ile yıkayın. Coulter sayaç hücreleri saymak.
      7. Tek hücre süspansiyon of 4i saf hiPSCs 27.0-32.4 x 9 mL prewarmed 4i tam orta 106 hücreler için sulandırmak. Not Bu 4i tam orta zaten Y27632 içerir.
      8. 8 de bir tri-Yakıt Ekstraktörü (2.4.3.9) 4i tam orta 1 mL içeren microwell plaka almak. 1 mL 4i saf hiPSC süspansiyon (3.0-3.6 x 106 hücreler/iyi) her kuyuya aşılamak. Bu hücre yoğunluğu önemlidir. Yavaşça pipetting tarafından hücreleri her kuyuya eşit şekilde dağıtılır emin olun.
      9. Microwell plaka, oda sıcaklığında, 100 x g 3 dk santrifüj kapasitesi.
      10. Yer microwell plaka bir tri-gaz CO2 kuluçka (37 ° C, % 6.5 O2, % 5 CO2). Microwells içinde pelleted hücreleri rahatsız etmeyin. Hücreleri 24-30 saat için kuluçkaya. Bir gecede kuluçka (~ 16 saat) genellikle sıkı EBs oluşumu için yeterli değil.
  5. Kültür (gün 6) sallanan için düşük ek plakaları EBs transferi
    1. (Gün 6 - gün 13) aşağıdaki gibi hPGCLC tam orta 50 mL santrifüj tüpü hazırlayın:
      20 mL hPGCLC bazal orta, 500 mM 2-Mercaptoethanol, 50 μL 20 mg/ml L-askorbik asit, 50 mm Y27632, 50 μL 100 μg/mL 4 μL 4 μL rekombinant insan BMP4, 500 μg/ml 4 μL insan SCF, 250 μg/mL insan EGF 4 μL ve 250 μg/ml 8 μL insan LIF.
      Not: taze hPGCLC tam orta kullanımdan hemen önce hazırlamak ve ışığa maruz kalma önlemek. HPGCLC tam depolamayın 4 ° C'de orta veya donmuş gece veya daha uzun.
      Not: BMP4 konsantrasyonu çok yüksek olduğunu. En iyi BMP4 konsantrasyon BMP4 gruplar arasında farklı olabilir. BMP4 çok çok fark şiddetle hPGCLC üretim etkiler. Tam hPGCLC orta BMP4 yokluğunda, hPGCLCs verimi çok düşük6' dır. Diğer sitokin tam hPGCLC orta önemini Hanna/Surani6tarafından tanımlanmıştır.
      Not: Bu protokol için son tam hPGCLC ortamda insan LIF 100 ng/mL6,10bölgedir. Bizimki de dahil olmak üzere önceden yayınlanmış çalışmalarda kullanılan son LIF konsantrasyonu 1 μg/mL yapıldı. Ne zaman insan LIF reaktif belirli aktivite > 10.000 adet/μg (ED50 < 0.1 ng/mL), 100 ng/mL LIF EBs hPGCLC nesilden desteklemek için yeterli.
    2. EBs aktarma
      1. Prewarm 5 mL hPGCLC bazal orta ve 20 mL hPGCLC tam orta için > su banyosu içinde 37 ° C'de 5 dak.
      2. Dikkatlice bir hücre süzgeç baş aşağı bir 50 mL polipropilen konik tüp üstüne koyun.
      3. Damlalıklı microwell her şey plaka çok yavaşça plaka EBs microwells ayırmak için. EBs içinde dahil değil hücreleri kaldırmak için hücre süzgeç aracılığıyla her şey tüm içeriğini filtre.
      4. 1 mL prewarmed hPGCLC bazal orta ile hücre süzgeç muhafaza EBs yıkayın. Yavaşça yıkama 5 kez tekrarlayın.
      5. Yıkanmış EBs şimdi 50 mL konik tüp ters üzerinde olan bir süzgeç, membran üzerinde korunur. Bir taze 50 mL konik tüp hücre süzgeç normalde yeni tüp yerleştirilir hücre süzgeç yerleştirin. Sonra hızlı bir şekilde yeni tüp ile hücre süzgeç tersine çevirin. Hücre süzgeç ve tüp şimdi normal pozisyonda ve EBs hücre süzgeç membran altında.
      6. EBs konik tüp 18 mL prewarmed hPGCLC tam orta hücre süzgeç membran yukarıda ekleyerek toplamak. Böylece, orta membran gitmek ve membran santrifüj tüpü dibine alt tarafındaki ekli EBs toplamak.
      7. EBs plaka süspansiyon düşük-Eki 6-şey plaka (3 mL/de) kuyu içine.
      8. Düşük-eki plaka bir tahterevalli-hareket rocker bir tri-gaz kuluçka (37 ° C, % 6.5 O2, % 5 CO2) yerleştirin. Küme sallanan hızı ~ 20 min döner.
        Not: dönen hareketi için geçerli değildir EBs toplamak wells ve sigorta ortasına. EBs toplamak değil sallanan hız dikkatli bir şekilde ayarlayın. Çok dinç sallanan fiziksel olarak EBs zarar verir.
        Not: Düşük oksijen basıncı EB kültür için önerilir.
  6. EBs (gün 7 - gün 13) yüzeyi hPGCLCs nesil
  7. Taze her gün 20 mL hPGCLC tam orta hazırlayın. Sallanan olmadan, EBs ~ 1 dk. Kaldır eski orta kurutma EBs (~0.2 mL/iyi eski orta kalabilir) olmadan wells alt batacağı ve taze hPGCLC tam orta her gün (3 mL/de) ekleyin.

3. immunohistokimyasal EBs (gün 10-gün 13) boyama

  1. Hücre dışı matriks proteini bloklar halinde formaldehit sabit, parafin gömülü (FFPE) immunostaining için EBs katıştırma
    1. HPGCLCs OCT4 olarak tanımlamak için+ hücreleri, hasat EBs bir 1,5 mL düşük-bağlama microcentrifuge tüpü. Altına lavabo veya kısaca (2 saniye) Oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi ve orta atın EBs izin. EBs buz gibi PBS(-) ile yıkayın.
    2. PBS(-) kaldırın ve buz gibi 1%(w/v) sodyum azid PBS(-) içinde buz üzerinde 5 min için 1 ml EBs kuluçkaya. Altına lavabo veya kısaca oda sıcaklığında (2 saniye) santrifüj kapasitesi EBs izin. Süpernatant atın ve EBs buz gibi PBS(-) ile durulayın.
      Not: Sodyum azid ilavesi intraselüler protein ve RNA transkript bozulma yavaşlatır.
    3. Hücre dışı matriks protein buz üzerinde 200 µL çözülme ve EBs içeren microcentrifuge tüp ekleyin. Jel katılaşmış kadar ~ 10 dakika oda sıcaklığında tüp bırakın.
    4. 1 mL % 4 formaldehit PBS(-) içinde ekleyin ve hafif sallanan ile 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: Her ikisi de bu adımı sırasında sabit EBs ve hücre dışı matriks proteini. Fiksasyon jel blok dehidratasyon işlemi sırasında ayrıştırmak. Eğer önceden sabit EBs jel blok içinde katıştırılır, EBs tekrar jel blok ile sabittir ve aşırı sabit olabilir.
    5. Formaldehit atın ve EBs kez buz gibi PBS(-) ile durulayın. 1 mL % 70 etanol ekleyin. EBs jel gömülü bir hafta boyunca 4 ° C'de % 70 etanol depolanabilir.
    6. Standart bir FFPE protokol ile jel gömülü EBs işlemek. 5 mikron kalınlıkta FFPE slaytlar hazırlayın. Gecede kuru ve immunostaining kadar oda sıcaklığında saklamak slayt izin.
      Not: Bizim rutin FFPE iletişim kuralı aşağıdaki gibidir: % 70 etanol, iki değişiklik, 1 saat her; % 80 etanol, bir değişiklik, 1 saat; % 95 etanol, bir değişiklik, 1 saat; % 100 etanol, üç değişiklik, 1.5 saat; ksilen, üç değişiklik, 1.5 saat; Parafin mumu (58-60 ° C), iki değişiklik, 2 saat. Susuz kalmış dokulara parafin blok gömülü ve 3-10 mikron (genellikle 5 mikron) kesme.
    7. Boyama için tamamen slaytlar için en az 30 dk Deparaffinize 56 ° C fırında kuru ve xylenes ve kademeli alkol serisi ile slaytlar hidrat. Sonra slaytlar musluk suyu 5 dakika yıkayın.
    8. Endojen peroxidases devre dışı bırakabilirsiniz için 10 dakika oda sıcaklığında BLOXALL çözüm engelleme ile rehydrated slaytlar kuluçkaya. Sonra slaytlar PBS ile 5 dakika yıkayın.
    9. Blok, oda sıcaklığında 20 dakika Normal at Serum (ya da diğer tür oluşturulan ikincil antikorların normal sera) ile slaytlar.
    10. Slaytlar bir anti-OCT-3/4 keçi birincil antikor gecede 4 ° C'de PBS(-) % 0.1 BSA ile seyreltilmiş kuluçkaya (seyreltme ve kuluçka koşulları her birincil antikor için en iyi duruma getir). PBS(-) kaydıraklı üç kez, oda sıcaklığında, 5 dk sonra yıkayın.
    11. Anti-keçi IgG (at tarafından oluşturulan horseradish peroksidaz Birleşik ikincil antikor; bkz: Malzemeler tablo) ile slaytlar, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. PBS(-) kaydıraklı üç kez, oda sıcaklığında, 5 dk sonra yıkayın.
    12. Karıştırın gerekli tutarlar ( Tablo malzemelerigörmek) yüzeylerde boyama DAB kullanımdan hemen önce ve tam DAB çözüm 5 dk. monitör DAB ters bir mikroskop kullanarak boyama için oda sıcaklığında boyama slaytları kuluçkaya ve reaksiyon durdurma ne zaman OCT4+ hücreleri görselleştirildiği slaytlar içinde akan musluk suyu hızlı durulama tarafından.
    13. Kademeli alkol ve xylenes serisi ile slaytlar kurutmak. Slaytları lazer-yakalama mikrodiseksiyon için hazırsınız demektir. Montaj orta kullanarak kalıcı FFPE slaytlar hazırlayın ( Tablo malzemelerigörmek) için yüksek çözünürlüklü mikroskobik gözlemler.

4. FACS zenginleştirme EBs (gün 10-gün 13) üzerinden hPGCLCs

  1. Embryoid gövde ayrılma kiti enzim karışımı hazırlanması
    1. Enzim Mix 1 50 µL ekleyerek enzim P için arabellek X ve girdap 1.900 µL hazırlayın. Prewarm enzim Mix 1 15 dakika 37 ° C su banyosunda.
    2. Enzim Mix 2 20 µL arabellek Y 10 µL enzim A ekleyerek hazırlayın.
    3. Mix enzim karışımları 1 ve 2 tam EB ayrılma enzim karışımı hazırlamak için.
  2. EBs dissociating
    1. Hasat EBs düşük ek plakaları ve 2 dakika süreyle 15 mL santrifüj tüpü oda sıcaklığında, 300 x g, santrifüj süpernatant atın ve EBs 10 mL PBS(-) ile resuspend. Santrifüj tekrar.
    2. Süpernatant atın ve EBs tam EB ayrılma enzim karışımı (4.1.3) ile resuspend. EBs ayrışmış kadar EB süspansiyon için 15-20 dk 37 ° C su banyosunda kuluçkaya. Kuluçka sırasında yavaşça damlalıklı EBs ayrılma kolaylaştırmak için her 3-5 dk. Alternatif olarak, otomatik bir dissociator Embryoid vücut ayrılma programını kullanın.
    3. Buz gibi 8 mL PBS(-) Disosiye EB hücre süspansiyon için ekleyin. Hücre süspansiyon 40-µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Yıkama hücre süzgeç 1 mL ile buz gibi PBS(-) üç kez.
    4. Coulter sayaç kullanarak filtre uygulanmış hücre süspansiyon hücreleri hesaplama.
    5. Hücre süspansiyon, 4 ° c, 300 x g 8 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücre Pelet buz gibi 10 mL PBS(-) ile resuspend.
    6. İki tüp, bir denetim (~ 105 hücreleri) Hayır boyama ve diğer anti-CD38 (tüm kalan hücreleri) boyama için hücre süspansiyon bölün.
    7. İki tüp 4 ° c, 300 x g 8 dk santrifüj kapasitesi.
  3. Anti-CD38 boyama ve hPGCLCs FACS zenginleştirme
    1. Hayır boyama denetimle 200 µL buz gibi %3 (w/v) BSA için hücre Pelet ve %1 (w/v) sodyum azid PBS(-) içinde resuspend. Akış Sitometresi kadar buza koyun.
      Not: CD38 içselleştirilmesi hücre yüzeyinden sodyum azid eklenmesini yavaşlatır.
    2. Hücre Pelet anti-CD38 buz gibi (w/v) BSA % 3 ve % 1 ' (w/v) sodyum azid PBS(-) içinde 100 µL başına 1 x 106 hücre ile boyama için resuspend.
    3. 1 x 106 hücre FACS sınıftan APC Birleşik anti-CD38 antikor başına 10 µL ekleyin. Gün ışığına maruz önlemek için alüminyum folyo ile tüp kapsar. 4 ° c hafif sallanan ile 45 dk için kuluçkaya.
    4. 5 mL ekleyin buz gibi PBS(-) ve santrifüj 4 ° C'de, 300 x g 8 dk. atma süpernatant ve resuspend hücre cips ile 5 mL buz gibi PBS(-). Yıkama PBS(-) ile toplamda üç kez tekrarlayın.
    5. Hücre Pelet 500 μL buz gibi (w/v) BSA % 3 ve % 1 (w/v) sodyum azid ile PBS(-) içinde bir hücre yoğunluğu FACS için yeterli resuspend.
    6. HPGCLCs CD38 olarak zenginleştirmek+ genellikle açıkça ayırt edici hücre nüfusu oluşturan hücreler. Hayır boyama denetim tanımlaması CD38 emin olmak için kullanın+ hücreleri. HPGCLCs tipik verimi % 1-5 gün 10 EBs üzerinden tüm FACS incelendiğinde tek hücre ve % 20-40 gün 13 EBs den vardır.

Representative Results

Burada kullanılan microwell plaka 24-şey biçiminde ve her biri çekmek ilâ 1200 oluşumu microwell sayfaları tutan 8 kuyu vardır EBs. Of 4i saf pluripotent hücreler yaklaşık 24 milyon bu microwell plaka tipik olarak ~ 8.000 üretir EB başına ~ 3.000 hücre oluşan EBs. Sürekli sallanan ile yapışık olmayan kültür EBs sırasında bozulmamış EBs sayısı yavaş yavaş kendiliğinden kendi kendine sökülmesi ve ~ 3.000 nedeniyle azalır EBs Protokolü'nün 13 gün kadar hayatta kalmak. En-in bunlar EBs hayatta var 50-200 hPGCLCs onların yüzeyinde (OCT4 + EBs seri bölümlerini hücrelerde immunohistokimyasal tespiti tarafından tahmini; bkz. Şekil 8), ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs Toplam verimli. EBs enzimatik sindirim tek hücreye 9.000-47.000 hücrelere FACS zenginleştirilmiş CD38 + hPGCLCs verimini azaltarak nispeten verimsiz bir süreçtir. Bizim ellerimizde deneyler altı bağımsız ama ardışık toplu işlemleri ortalama 14,038 ± 5,731 (± SEM demek) olduğunu. CD38 negatif EB hücreler hücreleri OCT4 mRNA (qPCR) veya protein (immünhistokimya) sadece çok zayıf hızlı değilse, çünkü tamamen yok, tüm EB hücreleri şiddetle CD38 + hPGCLCs tüm popülasyona hemen hemen eşdeğer OCT4 protein ifade.

Bu protokol kritik parametresi hücre yoğunluğu içerir. Ne zaman 2.0 x 105 insan iPSCs içinde bir hücre dışı matriks protein kaplı de, 6-şey hücre kültür plaka (2 büyüme alanı iyi ücret 9.60 cm) 2 mL Y27632 takıma Orta (2.2.9) ile aşılanmış, hücreleri için yaklaşık % 20-30 ulaşacak 24 confluency saat sonra aşılama (Şekil 1). MTeSR1 orta Y7632, hücre toplama ve form kolonileri yokluğunda ek bir 24 saatlik kültür sonra büyüme alanı (Şekil 2) % ~ 30'u işgal. Hücreleri sonra 4i programlama Orta (2.3.2) kültürlü. Kültür 4i orta, hücreleri haline birleşmesi (Şekil 3) 24 saat sonra. Ek bir 24 saatlik kültür 4i orta yoğun (Şekil 4) Paketli hücreleri yapar. Orta değiştirmek (+/-4 saat 24 saatte) ve hücre yoğunluğu tam zamanlaması EBs ve hPGCLCs başarılı oluşumu için kritiktir.

4i orta 48 saat kültür sonra hücreleri ayrışmış ve kuyu 400 µm boyutu (2.4) olan microwell plaka aşılandı. Bu piyasada bulunan microwell plaka için kaplı rağmen düşük yapışma yüzey deterjan (2.4.3) ile yeniden kaplama taze üretici tarafından istenmeyen hücre yapışma riskini azaltmak için önerilir. 800 µm microwells hPGCLCs, EB boyutu düzgün yönlendirilmiş farklılaşma için önemini telkin düşük verim sonuçlandı. Hücreleri 4i ortamda aşısını EBs microwells içinde 24-30 saat, bir standart, ters faz kontrast mikroskop (Şekil 5) kullanarak gözlenen oluşturacak. EBs dairesel kontur haline ve, kuluçka 24 saat sonra açıkça görülebilir. Önceki bir zamana (Örneğin 16 saat sonra aşı), EBs hasat onların dairesel dağılımı açıkça görünür olmadan böyle EBs Mekanik hasarlar için çok hassas ve kolayca ortadan kaldırmak için önerilmez. Saf hiPSCs önemli miktarda değildir Not normal olan EBs içinde dahil. Bu adi hücreler EBs kültür düşük-yapışkan yüzeyi (2.5.2) sallanan başlatma önce yıkanıp. Ayrıca bizim iletişim kuralında, EBs kurdu, 4i saf pluripotency orta - hPGCLC ortamda dikkat edin. Öncesi 4i orta hPGCLC orta maruz önce katı EBs oluşumu EBs yüzeyinde hPGCLCs, dağıtımı için önemlidir.

EBs tutulan bir sallanan altında hPGCLC orta yapışık kültür durumu küresel şekilleri toplama veya füzyon (Şekil 6 ve Şekil 7) olmadan koruyacaktır. Çok zayıf durumu sallanan EB toplama ve füzyon neden olur, ancak çok sert koşul EBs ortadan kaldırmak. İnsan PGCLCs OCT4 ifade hücreler EBs yüzeyi olarak 5 günlük kültür hPGCLC orta ve onların sayı artar gibi erken sonra 8 günlük Kültür (Şekil 8) kadar ortaya çıkar. EBs daha da kuluçka EBs ve hPGCLCs kaybı söküm neden olabilir. İnsan PGCLCs enzimatik Disosiye EB hücrelerden kültür hPGCLC orta 5-8 gün sonra FACS tarafından CD38 + hücreler (Şekil 9) olarak zenginleştirilmiş.

Figure 1
Şekil 1: insan IPSC hücre kültüründe Y27632 takıma orta 24 saat sonra aşı. Hücre yoğunluğudur yaklaşık 20-%30 konfluent. ROCK inhibitörü Y27632 huzurunda, hücreleri de uzun, spike gibi uzama ile yayılmış eğilimindedir. Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: insan IPSC hücre kültürü 48 saat sonra aşı. Hücreler büyüme alanı % ~ 30'u işgal formu kolonileri için toplamak. Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: insan IPSC hücre kültürü 24 saat boyunca 4i programlama ortamda inkübe. Hücreleri confluency için ulaşmak. Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: insan IPSC hücre kültürü 4i programlama ortamında 48 saat inkübe. Konfluent hücreleri yoğun paketlenmiştir. Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: insan IPSC EBs oluşan microwells içinde orta yeniden programlama 24 saatlik kuluçka sonra içinde 4i. 24-30 saat sonra aşı görünür hale EBs dairesel kontur. Kontur faz kontrast mikroskop altında onaylandığında, EBs sallanan bir kültür durumu aktarmak için hazır. Ölçek çubuğu 500 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: insan IPSC EBs inkübe hPGCLC Orta içinde 24 saat. EBs büyük ölçüde onların küresel şekli korumak. Ölçek çubuğu 500 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: insan IPSC EBs inkübe hPGCLC orta 192 saat. EBs görünümlerini, 24 saatlik kültürüne göre genişlemiş, ama onlar hala büyük ölçüde küresel şekillerle hiçbir toplama ya da füzyon korumak. Ölçek çubuğu 500 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: insan PGCLCs OCT4 ifade lokalize hPGCLC orta 192 saat inkübe EBs hiPSC yüzeyinde. EBs hücre dışı matriks proteini gömülü ve FFPE slayt immunohistokimyasal OCT4 boyama için işlenen (DAB substrat). Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: İnsan PGCLCs enzimatik Disosiye EB hücrelerden FACS CD38 olarak tarafından zenginleştirilmiş+ hücreleri. 5-8 gün boyunca hPGCLC orta kuluçka sonra EBs tek hücre süspansiyon hazırlamak için enzimatik sindirim tarafından ayrışmış. hPGCLCs CD38 zenginleştirilmiş+ hücreleri tarafından FACS (kırmızı nokta). CD38 ifade edemediği EB hücreleri (mavi noktalar)-da var toplanan negatif kontrol. FACS gates CD38 pozitif ve negatif CD38 hücre hücreleri her tür kirlenmesini önlemek için geniş kenar boşluğu ile (yeşil nokta) ayrılmalıdır. Alt ve üst panelleri FACS profilleri olmadan veya anti-CD38 antikor boyama, sırasıyla göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan protokolü kullanarak hPGCLCs sağlam üretimi normal diploit karyotip10ile insan iPSCs üç bağımsız klonları ile doğrulandı. Bu IPSC klonlar aynı insan yenidoğan dermal skin fibroblast hücre kültür10elde edilmiştir. Müfettişler istek üzerine ve altında uygun malzeme transfer anlaşması ve aranjman dondurulmuş canlı insan hücrelerinin nakliye için bu makalenin yazarları tarafından sağlanacaktır. Normal karyotip bizim iletişim kuralı ya da diğer laboratuvarlar tarafından bildirilen kullanarak sağlam hPGCLC üretim için gerekli olup halen bilinmemektedir.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda hPGCLCs hiPSCs11 veya Kyoto Üniversitesi8 Saitou'nın grup tarafından açıklanan bir iletişim kuralı kullanılarak ESCs14 üretimini EOMESODERMIN ifade üzerinde bağımlı olduğunu göstermiştir, bir T-box transkripsiyon faktörü için gerekli İndüksiyon SOX17. SOX17 insan pluripotent kök hücreler6germline ayrımında transkripsiyon faktörü belirleme ana soy olarak çalışmaya görünüyor. EOMESODERMIN EOMES Gen tarafından kodlanır ve EOMES CRISPR/Cas9 nakavt neden neredeyse SOX17 indüksiyon olmaması koşulu11üreten hPGCLC ve diğer genlerin ifade izledi aynı desen SOX17 null nakavt hücreleri. EOMESODERMIN overexpression EOMESindüklenebilir bir vektörde üzerinden-null nakavt hücreleri hPGCLC indüksiyon kültür sırasında etkili bir şekilde kurtarıldı sağlam hPGCLC üretim hem de indüksiyon germline gen, SOX17 de dahil olmak üzere. Buna ek olarak, indüklenen overexpression SOX17 de sağlam PGCLC üretim kurtarıldı ama EOMES inducing olmadan. Bu nedenle, EOMESODERMIN SOX17 bir kritik ters yönde uyarıcı ve bu insan pluripotent kök hücrelerden EOMESODERMIN tek en önemli rol hPGCLC indüksiyon içinde görünüyor. Bizim protokol SOX17 hiPSCs10dakika sonra indükler ama belirlenecek EOMESODERMINE indüksiyon bağımlı bekliyor.

Bu iletişim kuralı astarlanmalıdır pluripotency insan iPSCs mTeSR1 orta ERK bağımsız saf pluripotency için 96 değiştirilmiş saf insan kök hücre Orta (NHSM)5olduğu orta6, yeniden programlama saat için 4i içinde tutulan dönüştürür. Bizim girişimleri aynı insan IPSC klonlar ile başlayan ancak daha düşük hPGCLC verimleri derecelerde orta yeniden programlama kültür 4i sonuçlandı önce diğer ticari olarak mevcut insan IPSC büyüme medyada Bakımı hPGCLCs oluşturmak için. Bu gözlem öneriyor olup diğer ortamlarda daha uzun vadeli adaptasyon hPGCLC üretim artırır veya değil kalır gelecek çalışmalarda belirlenir rağmen önemli ölçüde yeniden programlama insan iPSCs 4i önce astarlanmalıdır pluripotency tam durumunu EB oluşumu 4i orta ve EB farklılaşma hPGCLC ortamda etkiler.

Bizim protokol sonrası hiPSCs üzerinden hPGCLCs yapımıdır güçlü ve son derece verimli üretimi çok sayıda EBs etkinleştirmek microwell plakaları kullanımı sayesinde kısmen tekrarlanabilir (~ 8.000 EBs toplu iş başına) ile üniforma büyüklük (EB başına 3.000 hiPSCs). EBs kolayca üretilen deney bizim protokolünü kullanarak tek bir toplu iş sayısı normal U-alt hücre kültür wells kullanarak yöntemlerden daha çok daha büyük olabilir. Çok sayıda eşit büyüklükte EBs düzgün hPGCLCs ile çivili üretimini küçük molekül ağırlıklı aktivatörleri veya PGC belirtimi etkileyen inhibitörleri tanımlamak için benzersiz fırsatlar yüksek üretilen iş kimyasal gösterimleri sağlayabilir veya onların Epigenetik yeniden programlama gibi biyolojik özellikleri. Böyle EBs da germline hücre toxicants, sadece çevresel kirleticiler ama kemoterapötik ajanlar gibi Ayrıca klinik olarak reçete ilaçlar da dahil olmak üzere çok sayıda toksikolojik değerlendirmeler için yararlı olabilir.

(İ) sağlıklı hiPSCs mTeSR1 hücre dışı matriks proteini, (ii) hücre belirtilen ve kesinlikle tam sayısı aşılamak için üzerinde saklanır kullanımı sunulan protokolü kullanılarak hPGCLCs sağlam ve tekrarlanabilir üretim kritik faktörler Orta değiştirmek ve alt kültür, (III) insan rekombinant BMP4 ve (iv) sırasında sallanan kültür EBs fiziksel zararlarını en aza indirmek için iyi bir sürü seçmek için zamanlamaları izleyin. 2 X veya daha büyük dozlarda BMP4 reaktifler diğer çok gerekli ise, en çok BMP4 reaktif 100 ng/mL konsantrasyonu çalıştı bizim deneyimdir. Diğer taraftan, verim hPGCLCs BMP4 en iyi sürü oldukça azaldı BMP4 daha yüksek dozlarda kullanma (Örneğin, 200 ng/mL). Rekombinant insan BMP4 reaktifler performanslarını hPGCLC üretimi destekleme için birden çok satıcı elde edilen birkaç farklı bir sürü test etmek ve en iyi çok büyük miktarda güvenliğini sağlamak için önerilir.

Diğer iletişim kuralları hPGCLCs hücre toplamları6,8ortasında oluşturabilirsiniz, ancak bizim hPGCLC iletişim kuralı benzersiz bir özelliği hPGCLCs EBs10 (Şekil 8), en dış yüzey katman üzerinde lokalizedir var. Embryoid organları yüzeyinde, dış kabuk, iç kabuk ve çekirdek gibi birden çok farklı katmanları oluşturmak eğilimindedir ve merkezi çekirdeğe bölgeler genellikle besin, oksijen gibi büyüme faktörleri sağlanan form kültür pro hayatta kalan sınırlı kaynağı nedeniyle kangren olan Orta difüzyon20tarafından. Yerelleştirme hPGCLCs EBs yüzeyi merkezi EBs doğru sınırlı difüzyon nedeniyle mümkün kısıtlama olmaksızın doğrudan, süre ve dozda kontrol maruz hPGCLCs, uyuşturucu ya da toksik maddeler için yararlı olabilir farmakolojik veya Toksikolojik çalışmalar.

Oysa kontrol fare PGCLCs gösteri sağlam genom çapında DNA demethylation sürecinden içeren bölgeleri en azından kısmen7,19,20, hPGCLCs genel gDNA demethylation derecesini fare zayıf görünüyor PGCLCS veya PGCs6,7. Transcriptomal profiller hPGCLCs embriyonik PGCs bir İngiliz kontu sahne fare PGCLCs10' dan benzeyebilir öneririz. Bu EBs hPGCLC üretim koşul altında uzun süreli kültür gDNA demethylation7artan bir ölçüde neden olduğu bildirilmiştir; Ancak, kültür hPGCLCs EBs veya izole hücreler olarak uzun bir süre daha ileri aşamalarında germline farklılaşma elde edebilirsiniz gelecekteki çalışmaları tarafından belirlenecektir gerekir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz Shiomi Yawata ve Şef Owa ilk çalışmaları sırasında teknik yardım almak için kabul edersiniz. Bu çalışmada NIEHS/NIH hibe R01 ES023316 ve R21ES024861 TS ve JHH uçuş görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü (FAMRI) hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel Corning 354277 Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 21041-025 Store at 4 °C.
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to
4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632 Axon 1683 Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10 STEMCELL Technologies 07930 Store at 4 °C.
Accutase Innovative cell technologies AT104-500 Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name Company Catalog Number Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific A1286101
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I1882-100MG Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF PeproTech 300-05 Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2 R&D Systems 4114-TC Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1 PeproTech 100-21 Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium Mix the following reagents to make 4i basal medium.
500 mL of KnockOut DMEM
100 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas
40 µL of 250 µg/mL human LIF
20 µl of 200 µg/ml human FGF2
4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1
Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021 Axon 1386 Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901 Axon 1408 Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796 Axon 1358 Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125 Tocris 1496 Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400 STEMCELL Technologies 27845 Microwell plate
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name Company Catalog Number Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM Thermo Fisher Scientific 11710035
Sodium pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360070
Penicillin-Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
hPGCLC basal medium Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium.
500 mL of Glasgow’s MEM
75 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
6 mL of 100 mM Sodium pyruvate
6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100)
Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4 R&D Systems 314-BP Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF PeproTech 300-07 Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF PeproTech AF-100-15 Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer Corning 352340 Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube Corning 352070
Low attachment plate Corning 3471
Vari-Mix Platform Rocker Thermofisher M79735Q
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution VECTOR SP-6000
Normal Horse serum
ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG		 VECTOR MP-7405
OCT-3/4 Antibody Santa Cruz SC-8629
ImmPACT DAB VECTOR SK-4105
Permount Thermofisher SP15-100 Mounting medium
Name Company Catalog Number Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC abcam ab134399

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).
  2. Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
  3. De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
  4. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
  5. Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  6. Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
  7. von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
  8. Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
  9. Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
  10. Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
  11. Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
  12. Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).
  13. Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
  14. Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
  15. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  16. Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
  17. Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
  18. Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  19. Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
  20. Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı 143 Primordial germ hücreleri primordial germ hücreli benzeri hücreler (PGCLCs) indüklenmiş pluripotent kök hücreler astarlanmalıdır pluripotency saf pluripotency embryoid organları
Pluripotent kök hücre üretimi insan ilkel Germ hücreli benzeri hücre Embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotent adlı indüklenen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitsunaga, S., Shioda, K.,… More

Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter