Eine automatisierte Methode zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit von Drosophila als Reaktion auf Temperaturänderungen in Raum und Zeit
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um automatisch bestimmen die lokomotorische Leistung von Drosophila bei schwankenden Temperaturen mit einer programmierbaren temperaturgeführte Arena, die schnell und präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert.
Abstract
Temperatur ist eine allgegenwärtige Umweltfaktor, das betrifft wie Arten verteilen und Verhalten. Verschiedene Arten von Drosophila Fruchtfliegen haben spezifische Reaktionen auf wechselnde Temperaturen entsprechend ihrer physiologischen Toleranz und Anpassungsfähigkeit. Drosophila -fliegen besitzen auch eine Temperatur sensing-System, die grundlegend für das Verständnis der neuronalen Grundlagen der Temperatur, die Verarbeitung in Kaltblütler geworden ist. Wir stellen Ihnen hier eine temperaturgeführte Arena, die schnelle und präzise Temperaturänderungen mit zeitlichen und räumlichen Steuerung, die Reaktion der einzelnen fliegen zu erkunden, wechselnde Temperaturen zulässt. Einzelne fliegen sind in der Arena platziert und vorprogrammierte Temperatur Herausforderungen ausgesetzt, wie einheitliche schrittweise Temperatur Reaktion Normen bestimmen oder räumlich verteilten Temperaturen gleichzeitig Vorlieben bestimmen erhöht. Einzelpersonen werden automatisch erfasst und erlauben die Quantifizierung der Geschwindigkeit oder Standort bevorzugt. Diese Methode kann verwendet werden, um schnell die Antwort über eine große Auswahl an Temperaturen Leistung Temperaturkurven in Drosophila bestimmen oder andere Insekten von ähnlicher Größe zu quantifizieren. Darüber hinaus kann es für genetische Studien verwendet werden, um Temperatur-Einstellungen und Reaktionen der Mutanten und Wildtyp fliegen zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, die Grundlage der thermischen Speziation und Anpassung sowie die neuronalen Mechanismen hinter Temperatur Verarbeitung aufzudecken.
Introduction
Temperatur ist eine Konstante Umweltfaktor, das betrifft, wie Organismen funktionieren und1Verhalten. Unterschiede in Breite und Höhe führen zu Unterschieden in der Art des Organismus ausgesetzt sind, die Ergebnisse in evolutionäre Auswahl für ihre Reaktionen auf Temperatur2,3Klimazonen. Organismen reagieren auf unterschiedliche Temperaturen durch morphologischen, physiologischen und verhaltensbezogenen Anpassungen, die maximale Leistung unter ihre besondere Umgebungen-4. Zum Beispiel haben in der Taufliege Drosophila Melanogaster, Populationen aus verschiedenen Regionen unterschiedliche Temperatur-Einstellungen, Körpergrößen, Entwicklungsstörungen Times, Langlebigkeit, Fruchtbarkeit und walking Leistung bei unterschiedlichen Temperaturen2 ,5,6,7. Die Vielfalt zwischen fliegen unterschiedlicher Herkunft beobachtet wird teilweise durch genetische Variation und Kunststoff Gen Ausdruck8,9erklärt. In ähnlicher Weise Drosophila -Arten aus verschiedenen Bereichen Temperaturgradienten anders verteilen und zeigen Unterschiede im Widerstand zu extremer Hitze und Kälte Tests10,11,12.
Drosophila ist vor kurzem auch das Modell der Wahl zu verstehen, die genetischen und neuronalen Grundlagen der Temperatur Wahrnehmung13,14,15,16,17geworden. Im großen und ganzen wahrnehmen Erwachsene fliegen Temperatur, durch kalte und warme periphere Temperatur-Sensoren in die Antennen und Temperatursensoren im Gehirn13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. die Peripherie-Rezeptoren für heiße Temperaturen auszudrücken, Gr28b.d16 oder Pyrexie21, während die Peripherie Kälterezeptoren zeichnen sich durch Brivido14. Im Gehirn wird die Temperatur von Neuronen, die mit dem Ausdruck TrpA115verarbeitet. Verhaltensstudien an Mutanten dieser Wege sind besser zu verstehen wie Temperatur verarbeitet wird und geben Einblicke in die Mechanismen, die Populationen von Drosophila aus verschiedenen Regionen sehr unterschiedlich sind.
Hier beschreiben wir eine temperaturgeführte Arena, die schnelle und präzise Temperaturänderungen produziert. Die Ermittler können diese Änderungen vorprogrammieren ermöglicht die standardisierte und reproduzierbare Temperatur Manipulationen ohne menschliches Zutun. Fliegen sind erfasst und verfolgt mit Spezialsoftware ihre Position und Geschwindigkeit in verschiedenen Phasen eines Experiments bestimmen. Der Messbildschirm präsentiert in diesem Protokoll ist die Gehgeschwindigkeit bei verschiedenen Temperaturen, weil es ein ökologisch relevanter Index der physiologischen Leistungsfähigkeit, die einzelnen thermischen Anpassungsfähigkeit5identifizieren können. Zusammen mit Temperatur-Rezeptor Mutanten kann diese Technik helfen, die Mechanismen der thermischen Anpassung auf zelluläre und biochemische Ebene zeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir eine automatische Temperaturkontrolle Arena (Abbildung 1) präsentiert, die präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert. Diese Methode ermöglicht die Belichtung der einzelnen Drosophila nicht nur vorprogrammierte schrittweise Erhöhung der Temperatur (Abbildung 2 und Abbildung 3), sondern auch dynamische Temperatur Herausforderungen in dem jede Kachel der Fliege Arena erhitzt wurde unabhängig…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein Stipendium von der Behavioural and Cognitive Neuroscience-Programm von der Universität Groningen und Diplom als Stipendiat der Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) aus Mexiko, gewährt, Andrea unterstützt Soto-Padilla, und einen Zuschuss von der John Templeton Foundation für das Studium der Zeit an Hedderik van Rijn und Jean-Christophe Billeter vergeben. Wir sind auch dankbar, Peter Gerrit Bosma für seine Beteiligung an der Entwicklung des FlySteps -Trackers.
Scripts, TemperaturePhases, FlySteps, und FlyStepAnalysis können als ergänzende Information und in den folgenden temporären und öffentlich zugänglichen Link gefunden:
https://Dataverse.nl/privateurl.XHTML?Token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
Referências
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