Summary

Un metodo automatizzato per determinare le prestazioni della drosofila in risposta a variazioni di temperatura nello spazio e nel tempo

Published: October 12, 2018
doi:

Summary

Qui presentiamo un protocollo per determinare automaticamente le prestazioni dell’apparato locomotore di Drosophila alle variazioni di temperatura usando un arena di temperatura programmabile che produce i cambiamenti di temperatura veloce ed accurato nel tempo e nello spazio.

Abstract

Temperatura è un fattore ambientale onnipresente che colpisce come specie distribuire e comportarsi. Diverse specie di mosche della frutta Drosophila hanno risposte specifiche alla variazione della temperatura secondo la loro tolleranza fisiologica e adattabilità. Drosofila mosche possiedono anche un sistema che è diventata fondamentale per comprendere le basi neurali della temperatura di lavorazione in ectotermi di rilevamento della temperatura. Presentiamo qui una arena temperatura controllata che consente cambi di temperatura veloce e preciso controllo temporale e spaziale per studiare la risposta di singoli mosche a temperature variabili. Mosche individuali sono collocati nell’arena ed esposti alle sfide di temperatura pre-programmati, come uniforme graduale aumenta di temperatura per determinare norme di reazione o temperature spazialmente distribuite allo stesso tempo di determinare le preferenze. Gli individui vengono monitorati automaticamente, consentendo la quantificazione della velocità o posizione di preferenza. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare rapidamente la risposta sopra un ampio range di temperature per determinare le curve di prestazione di temperatura in Drosophila o altri insetti di dimensioni simili. Inoltre, può essere utilizzato per studi genetici di quantificare le preferenze di temperatura e reazioni di mutanti o selvaggio-tipo mosche. Questo metodo può aiutare a scoprire la base della speciazione termica e adattamento, come pure i meccanismi neurali dietro lavorazione temperatura.

Introduction

Temperatura è un fattore ambientale costante che colpisce come organismi funzionano e comportano1. Le differenze in latitudine e altitudine portano a differenze nel tipo di climi organismo sono esposti, che si traduce in selezione evolutiva per le loro risposte a temperatura2,3. Gli organismi rispondono a diverse temperature attraverso adattamenti morfologici, fisiologici e comportamentali che massimizzano le prestazioni sotto loro particolari ambienti4. Per esempio, nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster, popolazioni provenienti da diverse regioni hanno preferenze diverse temperatura, dimensioni del corpo, volte inerente allo sviluppo, longevità, fecondità e prestazioni a piedi a diverse temperature2 ,5,6,7. La diversità osservata tra mosche di diverse provenienze si spiega in parte con variazione genetica ed espressione genica plastica8,9. Allo stesso modo, specie di Drosophila provenienti da diverse aree distribuire in modo diverso tra i gradienti di temperatura e mostrare le differenze nella resistenza a calore estremo e freddo test10,11,12.

Drosophila anche recentemente è diventato il modello di scelta per comprendere le basi genetiche e neurali della temperatura percezione13,14,15,16,17. In generale, mosche adulte percepiscono temperatura mediante sensori di temperatura periferica caldi e freddi nelle antenne e sensori di temperatura nel cervello13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. i recettori di periferia per alte temperature express Gr28b.d16 o piressia21, mentre la periferia freddi recettori sono caratterizzati da Brivido14. Nel cervello, la temperatura viene elaborato dai neuroni che esprimono TrpA115. Studi comportamentali su mutanti di queste vie sono migliorare la nostra comprensione di come la temperatura viene elaborato e dare spunti nei meccanismi che variano fra le popolazioni di Drosophila da diverse regioni.

Qui descriviamo una arena temperatura controllata che produce i cambiamenti di temperatura veloce e preciso. Gli investigatori possono pre-programmare questi cambiamenti, che consente per le manipolazioni di temperatura standardizzata e ripetibile senza intervento umano. Mosche sono registrati e monitorati con software specializzato per determinarne la posizione e la velocità nelle diverse fasi di un esperimento. La misura principale presentata in questo protocollo è la velocità di camminata a diverse temperature, perché è un indice ecologicamente rilevante di prestazione fisiologica che possa identificare adattabilità individuale termico5. Insieme a mutanti del recettore di temperatura, questa tecnica può aiutare a rivelare i meccanismi di adattamento termico a livello cellulare e biochimico.

Protocol

1. preparazione di alimento Medium Versare 1 L di acqua di rubinetto in un bicchiere di vetro 2L e aggiungere un ancoretta magnetica. Mettere il bicchiere su un piatto caldo magnetico a 300 ° C fino a quando non viene raggiunta la temperatura di ebollizione. Mescolare a 500 giri/min e aggiungere il seguente: 10 g di agar, 30 g di glucosio, 15 g di saccarosio, 15 g di farina di mais, 10 g di germe di grano, 10 g di farina di soia, 30 g di melassa e 35 g di attivo lievito secco. Quando il mix…

Representative Results

L’arena a temperatura controllata (Figura 1A) è costituito da tre tegole di rame cui la temperatura può essere autonomamente attraverso un circuito programmabile. Ogni piastrella rame possiede un sensore di temperatura che fornisce un feedback al circuito programmabile. Il circuito si attiva un alimentatore per aumentare la temperatura di ogni piastrella. Elementi passivi termoelettrici fungono da elementi di riscaldamento costante per mantenere la temperat…

Discussion

Qui abbiamo presentato un’arena automatizzata temperatura controllata (Figura 1) che produce i cambiamenti di temperatura preciso nel tempo e nello spazio. Questo metodo permette l’esposizione di singoli Drosophila non solo pre-programmati aumento graduale della temperatura (Figura 2 e Figura 3), ma anche a sfide di temperatura dinamico in cui ogni mattonelle dell’arena Vola era riscaldata in modo indipendente ad una temper…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di studio dalla comportamentali e Cognitive Neuroscience programma dell’Università di Groningen e una borsa di studio laureato il Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) dal Messico, concesso a Andrea Soto-Padilla e una borsa di studio della John Templeton Foundation per lo studio del tempo assegnato a Hedderik van Rijn e Jean-Christophe Billeter. Siamo inoltre grati a Peter Gerrit Bosma per la sua partecipazione nello sviluppo il tracker di FlySteps .

Script TemperaturePhases, FlySteps e FlyStepAnalysis può essere trovato come informazione supplementare e nel seguente link temporaneo e pubblicamente disponibili:
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?token=c70159ad-4d92-443D-8946-974140d2cb78

Materials

Arduino Due Arduino A000062 Software RUG
Electronics Board Ruijsink Dynamic Engineering FF-Main-02-2014
Power supply Boost XP-Power 48. V 65 W ECS65US48 Set to 53 Volt
Power supply Tile Heating XP-Power 15. V 80 W VFT80US15
Power supply Cooling XP-Power 15. V 130 W ECS130U515
Peltier elements Marlow Industries RC12-4 2 Elements, controlled DC feed
Heat sink Fisher Technik LA 9/150-230V Decoupled for vibration
Temperature sensors Measurement Specialties MCD_10K3MCD1 Micro Thermistor Probe
Copper block/tiles Ruijsink Dynamic Engineering FF-CB-01-2014
Auminum ring Ruijsink Dynamic Engineering FF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm RS Components 111-2300  White conductive tape
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED strip Ledstripkoning HQ-3528-SMD 60 LEDs per meter
Switch Power Supply Generic T-36-12
Logitech c920 Logitech Europe S.A PN960-001055
QuickTime Player Apple Computer Recording program
Tracking analysis software R Packages: pacman
Tracking analysis software MATLAB
Thermal Imaging FLIR T400sc
Graphs and Statisticts Software Graph Pad Prism
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100ML Siliconising agent
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25×95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%

Referências

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Citar este artigo
Soto-Padilla, A., Ruijsink, R., Span, M., van Rijn, H., Billeter, J. An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time. J. Vis. Exp. (140), e58350, doi:10.3791/58350 (2018).

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