Summary
昆虫出现模式的测量需要精确。现有系统仅半自动, 样本规模有限。我们通过设计一个使用微控制器的系统来精确测量大量新出现的昆虫的出现时间来解决这些问题。
Abstract
现有的昆虫出现模式的系统有局限性;它们只是部分自动化, 并且在它们能检测到的新出现昆虫的最大数量中受到限制。为了获得昆虫出现的精确测量, 系统必须半自动, 能够测量大量的新出现的昆虫。我们通过设计和构建一个自动化的系统来解决这些问题, 该系统可以测量多达1200名昆虫的出现。我们使用 arduino 微控制器修改了现有的 "落球" 系统, 以自动收集数据, 并通过多个数据通道扩大样本规模。多个数据通道使用户不仅能够增加样本大小, 还可以在一次实验中同时运行多个处理。此外, 我们还创建了一个 r 脚本, 将数据自动可视化为气泡图, 同时计算出现的中位日和时间。目前的系统是使用三维打印设计的, 这样用户就可以修改系统, 以便针对不同种类的昆虫进行调整。该协议的目的是研究时间生物学和压力生理学中的重要问题, 使用这个精确的自动化系统来测量昆虫的出现模式。
Introduction
在实验环境中准确测量陆生昆虫出现的时间是众所周知的困难, 需要一定程度的自动化。过去设计了几种机制, 要么采用 "落球" 原理, 使用落球和传感器, 要么采用漏斗式系统1、2、3的 "爆炸箱"。现有设计有两个限制: 1) 数据收集只是部分自动化, 2) 样本大小或可以检测到的紧急昆虫数量有限。这些问题降低了数据收集的精度, 这对研究外露和出现模式的时间具有重要意义。我们通过设计一个自动化且不受样本大小限制的系统来解决这些问题, 使用户能够更好地可视化出现节奏以响应环境提示。
我们的系统是对落球原理的改进, 最新版本的降球原理使用红外传感器以 6分钟的增量探测昆虫的出现2。我们的系统仍然使用红外传感器, 但也集成了 arduino 微控制器, 以记录每个出现事件的日期和时间到最近的秒。数据会自动存储到安全的数字 (sd) 卡中, 该卡可以作为逗号分隔的文件导出进行分析。分析是通过使用自定义 r 脚本自动化的, 该脚本将数据绘制为气泡图, 并确定出现的中位时间和日期。
多个通道使用户在数据采集方面有更大的灵活性。例如, 我们的多通道设计不仅最大限度地减少了 "堵塞" 传感器的影响, 还可用于增加样品尺寸。此外, 多个通道允许用户指定特定通道的处理方法, 以便它们可以在实验中同时运行。使用所有六个通道可以在一个实验中记录大约1200只新兴蜜蜂。据我们所知, 这是目前测量昆虫出现的系统中最大的样本规模, 使我们能够观察到针对环境线索的精细规模的出现模式。最后, 我们的系统受益于大多数部件都是3d 打印的这一事实。这将创建精确大小的组件, 从而降低在操作过程中发生错误 (如探测器堵塞) 的可能性。它还允许为其他研究系统进行定制。
该协议的目的是定制建立一个精确的自动化系统来测量昆虫的出现, 研究时间生物学和压力生理学中的问题。该系统一直是并将继续是调查与昆虫出现模式有关的未回答问题以应对环境线索的关键。在这里, 我们描述了它的组装和用于发现紫花苜蓿切叶蜜蜂, megachile 圆形数据在实验室的实验设置。该系统使用可编程微控制器实现自动化, 并可使用3d 打印部件进行定制。印刷衣架固定在含有蜜蜂巢细胞的管之后, 金属 bb。出现后, 金属 bb 从机架中释放, 通过红外传感器记录出现的日期和时间到 sd 卡。目前的设计针对m. rotundata进行了优化, 但稍作调整后, 可以适应其他种类的昆虫。
Protocol
1. 系统建设
- 使用 pla 长丝, 为正在构建的每个通道打印以下多个部件: 1个集热器歧管 (收集器 _ manifold. stl)、1个端盖 (端 _ cap. stl)、6个平台支架 (平台 _ 支持. stl)、4个管架基板 (base _ 一丝. stl) 和4个管架基板。管架面板 (面板)。确保打印机床足够大, 可以在打印前打印项目。所有 *. stl 文件均可在补充数据中找到。
- 3个平台支持和一个 33 x 30 厘米的波纹塑料, 使用热胶组装2个管架平台每个通道正在建设, 如图 2所示。波纹塑料可以在每个角落的一侧打分, 以便弯曲。
- 将电子设备安装到收集器歧管中。
- 将120ω电阻器焊接到红外发射器和红外探测器的阳极 (长腿) 上, 将 ~ 5 厘米长的 22 ga 线焊接到两个阴极上。使用不同颜色的电线, 以避免在以后的步骤中出现混淆。
- 小心地将检测器插入收集器歧管的一个插槽 (在图 3中以蓝色突出显示), 将发射器插入第二个插槽 (以红色突出显示)。这两个组件都应紧贴。
- 通过电缆通道 (在图 3中以黄色突出显示) 输入探测器线, 并通过通孔 (以绿色突出显示) 拉动所有四根电线。确保没有裸露的电线接触, 使用热胶将其固定到位。
- 使用后面的引脚将所有四条电线焊接到 rj45 (以太网) 插孔。两个阳极应焊接到最左边的引脚, 发射器的阴极到最右边的引脚, 探测器的阴极焊接到其中一个中心引脚上 (图 4)。
- 用热胶将 rj45 插孔固定在集电极歧管访问孔 (在图 3中以绿色突出显示) 上, 确保流形内部没有裸线接触。
- 构造落球收集器 (每个通道 1个), 如图 5所示
- 使用一个有线集热器歧管、一端盖和 24 x 30 厘米段的波纹塑料, 使用热胶连接设备的底部 (图5的红色、绿色和浅灰色组件)。
- 使用 8 x 27 厘米的波纹塑料段, 在收集器中添加一个落球坡道 (图 5中的深灰色成分)。端盖和集热器歧管设计包括边缘, 以确保正确放置。检查从坡道到收集器的平稳过渡, 以避免在使用过程中出现卡纸。
- 构建系统的中央处理器 (如图 6所示)。
- 打印用于系统构建的自定义印刷电路板。pcb 板打印所需的所有文件均可在补充数据中找到。
- 在贴有以下装置标签的通孔上的焊女头: arduino nano、温度、时钟、sd 模块和液晶显示 (lcd) 屏幕 (pcb 板左上角未标记的 2 x 5 通孔区域)。
- 沿 pcb 板的下边缘捕捉和焊接 6个 rj45 插孔。
- 焊接 6 470k 欧姆下拉电阻器进入位于 rj45 千斤顶上方的通孔点。
- 将 arduino nano、dht 温度和湿度传感器、时钟和 sd 模块安装到 pcb 板上。在实验中使用 dhtc 温度和湿度传感器之前, 应进行测试, 以确保准确性。
- 将10连接器带状线连接到 pcb 板的液晶屏连接器。将色带线的另一端焊接到 lcd 屏幕上, 使屏幕引脚与 arduino 引脚相对应, 如图 4所示。有关液晶屏布线的更多详情, 可在 https://Learn.adafruit.com/character-lcds/wiring-a-character-lcd。
- 系统编程
- 从 www.arduino.cc 下载并安装最新版本的 arduino ide, 以实现正确的操作系统。
- 首次使用时, 安装 arduino 库的实时时钟 (githubg. comnécomnétorper/rtclecb) 和温度湿度传感器 (githubu. comnédht-sover-secor-bho-库)。使用库中包含的 ds1307 脚本将时钟设置为当前本地时间。
- 上传系统 arduino 脚本, 可在补充数据中找到。
2. 系统使用
- 组装系统, 如图 7所示。对于正在使用的每个通道, 一个落球收集器 (在步骤1.4 中组装) 应在两侧的两侧有一个机架平台 (在步骤5.1 中组装)。使用包装胶带将件固定在一起, 并在机架平台上创建平滑的圆角边缘。
- 配置未使用的通道, 以避免误信号。由于系统依赖低信号来检测事件 (红外探测器未接收到来自红外发射器的信号), 因此必须对未使用的通道进行适当配置, 以避免误报信号。这可以通过两种方法之一来实现。
- 通过注释与未使用的通道相对应的循环, 停用软件中未使用的通道。在 arduino ide 中, 可以通过在不需要的循环之前添加 "/*" 和在其末尾添加 "*/" 来实现这一点。
- 通过简单的硬件住宿停用未使用的通道。只需将电线焊接在一起 #6 和 #8 (通常是市售 cat 6 电缆的实心棕色和实心绿色电线), 并插入中央处理器上的空 rj45 插孔。
- 在进行实验之前, 立即装入管架并放置管架。
- 确保所有孔都包含 0.5 ml 的微离心管, 并取下瓶盖, 并且管紧贴。
- 每个管充满一个昆虫巢细胞, 木偶箱或茧, 一个空气软颗粒, 最后一个金属 bb。确保育苗细胞的扁平边缘侧 (盖) 朝向空气软颗粒和金属 bb。用圆角的边缘将管架面板贴在一起, 用-4 英寸尼龙螺丝。
- 将管架放置在机架平台上, 开口面向落球收集器。机架应放置在平台的边缘, 以便金属 bouncing 可以自由地落入收集器, 而不会反弹到结构的另一部分 (图 7)。放置机架时, 从开口朝上开始, 然后轻轻旋转到位, 以确保金属 bb 不会被释放。机架的设计是为了使管道在适当放置时稍微向后倾斜, 减少了金属 bb 意外释放的可能性。
- 将 sd 卡插入适配器, 然后通过将微型 usb 连接器插入 arduino 和另一端插入任何适当的 usb 适配器来启动中央处理器。准备好后, 液晶屏将显示数字1到6。将单个金属 bb 放入每个通道的球收集器中, 并观察相应的计数显示在屏幕上, 并在屏幕底部显示正确的时间。
- 如果未显示正确的时间, 请重复步骤 1.6.3, 并1.6.4 重置时钟。
- 如果未记录测试金属 bb, 则收集器将被阻塞。直观地检查是否堵塞, 然后重新启动系统。
- 如果通道每秒 "计数" 一个事件, 则表示通道连接不正确。检查所有连接并重新启动系统。
3. 实验结束和数据分析
- 出现后 (有关时间尺度的示例, 请参见结果和图8和图 9 ), 通过拔下 arduino 来关闭设备。机架可以拆卸和清洗, 以便重复使用。
- 在实验过程中, 数据存储在 sd 卡上的逗号分隔文件 (csv), 可通过 r 编程语言访问。使用 sd 卡将数据传输到计算机, 使用 rstudio 自动生成数据的气泡图。
- 事件和温度数据都保存在同一文件中, 以确保数据完整性。因此, 在进行分析之前必须完成一些处理。将逗号分隔的文件导入到电子表格程序中。第1栏和 j 栏是蜜蜂出现的日期和时间;通过剪切 a-e 列并将其粘贴到第二个电子表格中, 并将其另存为单独的文件, 使它们的列 a 和 b 成为一列, 这是温度数据。
- 标题列 a, "日期" 和列 b "时间", 并按列 a 排序数据, 然后由 b. 另存为 csv。文件。
- 从 https://www.r-project.org/下载并安装最新版本的 rstudio。使用 rstudio 上传和分析数据的帮助可在 https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.html 中找到。
- 使用补充数据中可用的 r 脚本, 将数据上载到 rstudio 中。更改 r 脚本中的工作目标, 使其与 excel * 匹配的位置。找到 csv 文件。运行脚本并选择要分析的数据文件。在 r 控制台中键入 "绘图"。气泡图将位于名为 "高度" 的工作目标中, 并重命名此文件以保存为高分辨率 tiff (300 dpi) 文件。
Representative Results
m. 圆形数据的出现是异步的, 不会暴露在环境提示下, 整个第4天的出现是一致的。然而, 当暴露在方波热周期 (4°c 热周期), 出现成为同步的热酶4,5。这一结果类似于其他研究, 其中昆虫已被发现使用热周期提示来调节出现, 包括果蝇 sarcophaga crassipalpis6, 洋葱苍蝇delia atiqua7和 boll 象鼻虫圣生科斯·格罗斯·格里斯8岁。一项研究表明, 发育过程中的压力会影响成人出现的同步性。在这里, 我们提出了在开发过程中暴露在压力下的圆形数据的结果, 以检验这种治疗方法导致成人出现的去同步的假设。
成功运行
用户在打开孵化器之前, 应注意液晶屏, 以确保昆虫不再出现。实验完成后, sd 卡将被删除, 数据可以作为逗号分隔的文件导出到 rstudio 中, 以便将其可视化为气泡图, 如前面所述。图 8显示了在发展过程中暴露在冷应力下的4°c 热周期下蜜蜂出现。红色十字线表示中位时间和出现日期, 文件名为标题。此 r 脚本应用于可视化数据, 但不应作为唯一的分析。为了分析环境提示的出现响应, 可以分析数据的节奏性 (见分析).
并发症
当传感器被金属 bb 堵塞时, 信号的缺乏会被反复计算, 从而产生多个错误的数据点。图 9演示了图 8中显示的相同数据集, 但六个通道中的一个被 bb 堵塞, 因此在图形上产生了大气泡。在传感器堵塞的情况下, 可以很容易地从分析中删除来自该通道的数据。在实验中引入多个通道有助于最大限度地减少堵塞传感器的影响。
分析
可以通过计算 "参数 r" 来分析同步存在的数据, 该参数统计信息可确定是否出现有节奏或心律失常10、11、12.这是通过在8小时窗口中计算最多的新兴成年人, 将这一数字除以8小时窗口外出现的成年人人数, 然后乘以100。所有出现的个人都应集中起来, 计算一天中每小时的新兴成年人的人数。参数 r 的理论范围是从 0 (所有诞生发生在门之内) 到 200 (诞生均匀地分布在一天)10。r 值 < 60 被认为是有节奏的出现, 60 < r < 90 是弱节律性的, r > 90 是心律失常。r 值 > 150 表示出现10的均匀分布.图 8显示出现是有节奏的参数 r = 20.21 < 60。由于这类数据是围绕重复的24小时时钟分布的, 因此必须使用循环统计数据进行更可靠的分析 (bennett等人, 2018年, 5岁)。这可以通过可用于 rstudio (包 "循环"-ran) 的循环统计包来实现。r-project. org)。
图 1: 添加剂制造的组件.使用 pla 长丝, 3d 打印系统所需的部件。对于正在构建的每个通道, 所需的部件有1个集电极歧管 (绿色)、1个端盖 (红色)、6个平台支持 (橙色)、4个管架基板 (紫色) 和4个管架面板 (黄色)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 管架平台组件.使用热胶组装两个管架平台, 每个通道正在构造。使用三个平台支持 (显示橙色) 与一段波纹塑料 (显示为灰色)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 集热器流形 x 射线.将一个红外探测器插入收集器的一个插槽 (以蓝色显示) 和发射器插入第二个插槽 (以红色显示)。通过电缆通道 (以黄色显示) 输入探测器线, 并将所有四根电线拉出通孔 (以绿色突出显示)。确保没有裸露的电线接触, 使用热胶将其固定到位。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 连接器布线.rj45 插孔在贴在集热器歧管之前的接线图, 从插孔底部和接线表中可以看到, 用于将 lcd 屏幕连接到中央处理器。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 球收集器组件.使用单端盖 (显示为红色)、一个集热器歧管 (以绿色显示) 和一个 24 x 30 厘米的波纹塑料 (以浅灰色显示) 组装球收集器组件的外壳。使用 8 x 27 厘米的波纹塑料 (显示在深灰色) 添加一个坡道。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 中央处理器 pcb 板.中央处理器的 pcb 板由底层 (绿色描绘)、顶层 (用红色描绘) 和丝印层 (用蓝色描绘) 组成。焊接女性头到所有直通孔, 除了那些 rj45 插孔 (沿底部) 和下拉电阻 (直接以上的 rj45 垫)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 最终程序集.使用时, 该装置应在所使用的每个球收集器的两侧安装管架平台。带连接面板的管架应放置在管架平台的边缘, 从而减少 bouncing 从设备上弹跳的可能性。组装设备的占地面积约为25厘米 x35 厘米, 高度为20厘米,请点击此处查看此图的较大版本.
图 8: r 中处理后的典型实验运行图.请点击这里查看此图的较大版本.
图 9: 受堵塞探测器影响的实验图, 如第4天相对较大的气泡所示.可以从分析中删除堵塞的通道, 从而保留剩余的数据点。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
我们提出了一个组装和使用系统的协议, 可以精确测量昆虫出现的时间。该系统解决了两个限制了以前设计的问题: 部分自动化和有限的样品尺寸。我们通过使用微控制器自动收集数据来解决这些问题, 这也使我们能够通过使用多个通道来增加样本量。目前的设计有六个频道, 总共可以容纳1200只蜜蜂。如果需要, 可以添加或减去其他通道, 不仅可以增加样本量, 还可以同时调查多种治疗的效果。下面将讨论关键步骤、修改、限制和未来的应用。
系统中唯一没有自动化的部分是在实验开始时将机架装上育苗电池、金属 bb 和空气软颗粒。虽然机架的设计使其稍微向后倾斜, 以防止金属 bb 在机架直立时掉落, 但在放置机架时必须小心, 以防止金属 bb 的意外释放。此外, 确保机架与机架边缘齐平, 使金属 bb 的坠落轨迹与跑道对齐。最后, 应清除跑道上的叶片碎片, 并清除从以前的实验中持有金属 bb 的底盘, 以防止传感器堵塞。数据将作为 csv 文件自动记录到 sd 卡中, 并编写脚本, 以便除非存在 sd 卡, 否则 arduino 将不会运行。数据文件手动导入到 rstudio 中, 并使用前面提到的 r 脚本进行可视化。此脚本将自动将数据绘制为气泡图, 并确定出现的中位时间和日期。arduino 脚本被写入将事件数据追加到文件的末尾, 以防止在发生电源故障时丢失数据。但是, 这也意味着, 一旦从 sd 卡中提取数据, 就应该在下一次实验之前清除所有文件。
可以对张草图文件进行修改, 以调整不同尺寸昆虫的机架大小, 修改后的机架中使用不同尺寸的管。此外, 空气软颗粒的大小是重要的, 因为它可以防止昆虫离开管, 和颗粒不同的大小, 以及可能需要。可以对 r 脚本进行各种更改, 以更改气泡图的外观和其他图形参数。
我们通过编写一个可在检测到金属 bb 后禁用任何给定通道一秒钟的借记代码来降低误报的风险, 从而防止单个金属 bb 被视为多个数据点。虽然, 这就造成了一个数据点被错过的可能性, 如果许多蜜蜂同时出现, 但事实是渠道是独立的, 减少了这种风险。目前系统的另一个局限性是, 个别数据点无法识别,即金属 bb 下降不能追溯到特定的个人。此外, 目前的系统测量的是圆形数据的出现而不是收缩节律, 但将测量出现和反转是同义词的物种的收缩节律。最后, 目前的设计不耐候性强, 将其使用限制在受控环境中。
未来的应用包括研究其他非生物和生物环境线索对m. rotundata的时间出现的影响。此外, 由于昆虫占据不同的环境, 相关的环境线索因物种而异。因此, 吸收更多的昆虫物种对于研究分类群间的生物钟系统是如何进化的非常重要的。人们对发育条件如何影响成人出现的时间了解甚少;因此, 我们的系统可以用来解读治疗对出现的影响。此外, 环境线索的组合会影响昆虫的反应, 因此未来的实验应该包含多种环境线索, 以了解它们对出现的相对影响。最后, 在现场部署, 观察自然环境如何调节出现节奏是令人感兴趣的。该系统的易用性, 以及其添加剂制造、开源编程和可观察到的生物特性的独特组合, 使其成为教育环境中使用的候选系统。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢 nd 法戈的昆虫冷冻生物学和生态生物学工作组对使用所述系统进行的实验的有益反馈。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLA printer filament | www.lulzbot.com | various | Catalog number varies by color |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | www.daigger.com | EF4254C | |
| 4.5 mm size "bb" metal pellets | www.amazon.com | B00419C1IA | Daisy 4.5 mm metal size bb pellets |
| 6.0 mm plastic "softair" pellets | www.amazon.com | B003QNELYE | Crosman 6 mm airsoft pellets |
| Plastic corregated sheet | www.lowes.com | 345710 | Corrugated plastic sheet |
| Infrared emmiter/detector pair | www.amazon.com | B00XPSIT3O | 5 mm diameter, 940 nm wavelength |
| 120 ohm resisitors | www.amazon.com | B01MSZK8DV | 120 ohm, 1/4 watt |
| 22 GA hookup wire | www.adafruit.com | 1311 | |
| RJ45 jacks | www.sparkfun.com | PRT-00643 | |
| Custom PCB board | www.pcbexpress.com | n/a | Can be printed from files included in the supplimental data |
| Arduino Nano v 3.0 | www.roboshop.com | RB-Gra-01 | |
| SD card module | www.amazon.com | DFR0071 | DFRobot SD card module |
| Real Time Clock module | www.adafruit.com | 264 | DS1307 real time clock breakout board |
| Temperature/humidity sensor | www.tinyosshop.com | G4F4494F29ED05 | DHT11 temperature/humidity sensor on breakout board |
| 470k ohm resistors | www.amazon.com | B00EV2R39Y | |
| Female headers | www.adafruit.com | 598 | Break off to desired length |
| Male headers | www.adafruit.com | 392 | Break off to desired length |
| Ribbon wire | www.amazon.com | B00X77964O | 10 wire ribbon wire with connectors |
| LCD screen | www.adafruit.com | 198 | |
| Cat6 cable | www.amazon.com | B00N2VISLW | |
| SD card | www.amazon.com | B00E9W1URM |
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