Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades
Summary
Rica em cisteína peptídeos dobram em distintas estruturas tridimensionais dependendo sua conectividade de dissulfeto. Síntese alvo de isómeros de bissulfeto individual é necessária quando oxidação de reserva não implica que a conectividade de bissulfeto desejado. O protocolo lida com a síntese seletiva de peptídeos 3-bissulfeto-ligado e sua análise estrutural usando estudos NMR e MS/MS.
Abstract
Peptídeos com um elevado número de cisteínas geralmente são influenciados em relação a estrutura tridimensional por sua conectividade de bissulfeto. Assim, é altamente importante para evitar a formação de ligação dissulfeto indesejáveis durante a síntese do peptide, porque pode resultar em uma estrutura completamente diferente do peptide e consequentemente alterado Bioatividade. No entanto, a correta formação de múltiplas ligações de bissulfeto em um peptídeo é difícil de obter por meio de métodos Self dobramento padrão tais como protocolos de oxidação do amortecedor convencional, porque vários conetividades dissulfeto podem ser formadas. Este protocolo representa uma estratégia avançada necessária para a síntese de alvo de múltiplas em ponte dissulfeto de peptídeos que não pode ser sintetizado através da oxidação de reserva na alta qualidade e quantidade. O estudo demonstra a aplicação de uma estratégia de grupo protegendo distintas para a síntese de todos os isómeros possíveis do peptide 3-bissulfeto-ligado de µ-conotoxina PIIIA de forma orientada. Os peptídeos são preparados pela síntese de peptídeo de fase sólida baseada em Fmoc usando uma estratégia de grupo protegendo para formação de ligação dissulfeto definidos. Os respectivos pares de cisteínas estão protegidos com trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) e tert-butílico (tBu) protegendo grupos para certificar-se que, durante cada etapa de oxidação somente as necessárias cisteínas são deprotected e ligadas. Além da síntese de alvo, uma combinação de vários métodos analíticos é usada para esclarecer o correto dobramento e geração das estruturas de peptídeo desejado. A comparação dos diferentes isômeros 3-bissulfeto-ligado indica a importância da determinação precisa e conhecimento da conectividade bissulfeto para o cálculo da estrutura tridimensional e a interpretação do biológico atividade dos isômeros do peptide. A caracterização analítica inclui a elucidação de ligação dissulfeto exata através de análise de espectrometria de massa (MS/MS) em tandem, que é realizado com derivados alquilados e parcialmente reduzidos do isômero intacta peptídeo produzido por um protocolo adaptado. Além disso, as estruturas do peptide são determinadas usando 2D da ressonância magnética nuclear (NMR) experiências e os conhecimentos resultantes da análise de MS/MS.
Introduction
O uso de peptídeos bioativos em pesquisa farmacêutica e desenvolvimento é altamente reconhecido, porque eles representam compostos potentes e altamente seletivos para alvos biológicos específicos1. Para sua bioatividade, no entanto, a estrutura tridimensional é de grande importância a fim de realizar a relação estrutura-atividade estudos2,3,de4. Além da sequência de aminoácidos primários que influencia a conformação geral, ligações de bissulfeto significativamente estabilizem a estrutura de peptídeos ricos em cisteína5. Vários peptídeos em ponte dissulfeto incluem conotoxins como µ-PIIIA de Conus purpurascens que contém seis cisteínas na sua sequência. Este conteúdo elevado de cisteína, teoricamente, permite a formação de 15 isómeros de dissulfeto. A conectividade de bissulfeto correta é muito importante para a atividade biológica6,7. No entanto, a pergunta que surge é se há mais de uma conformação Bioativo de peptídeos naturais e se então, que os isómeros possui a maior atividade biológica? No caso de µ-conotoxins, os alvos biológicos são canais de íon sódio voltagem-dependentes, e µ-PIIIA em particular é mais potente para subtipos de nd ndV1.2,V1.4 e atV1.73.
A síntese de peptídeos em ponte dissulfeto pode ser conseguida usando vários métodos. O método mais conveniente para a formação de ligações de bissulfeto dentro de um peptídeo é a chamada abordagem Self dobramento oxidativa. Aqui, o precursor linear do peptide cíclico desejado é sintetizado primeiro usando a síntese do peptide de fase sólida, que é após a clivagem do suporte polimérico submetidos a oxidação em um sistema de buffer. Agentes de redox-ativo como glutationa oxidada e reduzida (GSH/GSSG) são frequentemente adicionados para promover a formação das ligações de bissulfeto. A principal desvantagem do self com suporte buffer de dobramento é que as ligações dissulfureto são formadas não seletivamente de forma gradual. Comparado com o peptídeo nativo, para o qual muitas vezes é descrito isômero bissulfeto específico apenas um, é possível obter inúmeros outros isômeros com esta abordagem8. µ-PIIIA já foi mostrado para resultar em pelo menos três isômeros diferentemente dobrados sobre self dobrar em um estudo anterior3. A separação de tal uma mistura de isômero é um pouco difícil devido a tempos de retenção similares se utilizando de métodos cromatográficos de purificação9. A síntese de alvo de um isómero específico, portanto, é vantajosa. Para especificamente produzir que um isômero com conectividade de bissulfeto definido, uma estratégia especial é necessário que o dissulfeto títulos sucessivamente estão fechadas. Portanto, o precursor linear carregando grupos distintos protegendo os pares individuais cisteína é sintetizado com o apoio do polímero. Após a eliminação, os pares de cisteína são individualmente e sucessivamente deprotected e ligados em uma reação de oxidação para produzir o desejado dissulfeto títulos10,11,12,13, 14 , 15 , 16. após a síntese e a purificação do produto da reação, é necessário para confirmar a identidade e a conectividade de dissulfeto por métodos analíticos apropriados. Numerosos métodos analíticos estão disponíveis para a elucidação da sequência primária de aminoácidos, por exemplo., MS/MS, enquanto a determinação da conectividade bissulfeto continua a ser muito menos investigada. Além da complexidade de tais vários peptídeos dissulfeto-ligado, impurezas relacionados com o produto (ex., de bissulfeto lutando), devido à amostra preparação e check-up podem complicar ainda mais as análises. Neste trabalho, mostramos que o uso de uma combinação de diferentes técnicas analíticas é necessário clarificar inequivocamente a identidade das ligações de bissulfeto nos isómeros µ-PIIIA. Nós temos combinado métodos de cromatografia em fase gasosa com espectrometria de massa e desde que as mesmas amostras para espectroscopia RMN. Em matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS análise, identificamos as ligações de bissulfeto usando redução parcial e iodoacetamide derivatização porque análise top-down, não é possível para este peptídeo. 2D NMR experimentos foram realizados a fim de obter uma estrutura tridimensional de cada isômero. Assim, combinando diferentes métodos analíticos sofisticados, é possível elucidar corretamente a conectividade de bissulfeto e estrutura tridimensional do complexo vários peptídeos dissulfeto-ligado7.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui descrito para a síntese de peptídeos ricos em cisteína como µ-PIIIA representa uma possibilidade de produzir seletivamente dissulfeto-ligado de isômeros da mesma sequência de aminoácidos. Portanto, estabeleceu métodos como sólido baseado em Fmoc fase de síntese do peptide18 e uma estratégia de grupo protegendo definida para a formação de regioselective de ligações de bissulfeto foram usados16. A síntese do peptide de fase sólida pode produzir…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a r. Resemann, F. J. Mayer e D. Suckau da Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, r. r. Tietze, Schmidts V. e C. Thiele da Universidade de tecnologia de Darmstadt; O. Ohlenschläger o Jena FLI, M. Engeser, da Universidade de Bona; K. Kramer, r. Harzen e H. Nakagami, do Instituto Max Planck para pesquisa de reprodução da planta, Colónia; Susanne Neupert do Instituto de Zoologia, Colónia; e as instalações de espectroscopia de ressonância magnética Biomolecular da Universidade de Frankfurt para técnico suporte, módulos, de formação e acesso aos instrumentos. Apoio financeiro da Universidade de Bonn ao D.I. com gratidão é reconhecido.
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
Referências
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