Summary
Det här protokollet beskriver en endothelial differentiering teknik för hjärt stamceller. Det fokuserar särskilt på hur serumkoncentration och cell-sådd densitet påverkar endothelial differentiering potential.
Abstract
Hjärt stamceller (CPC) kan ha terapeutiska potential för hjärtats förnyelse efter skada. I vuxna däggdjur hjärtat, inneboende CPC är mycket knappa, men utökade CPC kan vara användbar för cellterapi. En förutsättning för deras användning är deras förmåga att skilja på ett kontrollerat sätt i de olika hjärt härstamningar via definierade och effektiv protokoll. Dessutom, vid in vitro- expansion, CPC isolerade från patienter eller prekliniska sjukdomsmodeller kan erbjuda givande forskningsverktyg för utredning av sjukdomsmekanismer.
Aktuella studier använda olika markörer för att identifiera CPC. Dock uttrycks inte alla av dem i människor, som begränsar translationell effekten av vissa prekliniska studier. Differentiering-protokoll som är tillämpliga oavsett isolering teknik och markör uttrycket möjliggör standardiserad expansion och priming av CPC för cell terapi ändamål. Här beskriver vi att grundningen av systemet under en låg fetalt bovint serum (FBS) koncentration och låg cell densiteten villkor underlättar endothelial differentiering av CPC. använder två olika subpopulations av mus och råtta CPC, visar vi att laminin är en mer lämpliga substrat än Fibronektin för detta ändamål enligt följande protokoll: efter odling för 2-3 dagar i medium inklusive kosttillskott som upprätthåller multipotency och med 3,5% FBS, CPC är seedade på laminin på < 60% sammanflödet och odlade i tillägg-fri medium med låga koncentrationer av FBS (0,1%) i 20-24 timmar innan differentiering i endotel differentiering medium. Eftersom systemet är en heterogen befolkning, kan serumkoncentrationer och inkubationstider behöva justeras beroende på egenskaperna för respektive CPC subpopulationen. Med tanke på detta, tekniken kan tillämpas på andra typer av systemet samt och ger en användbar metod för att undersöka möjligheter och mekanismer för differentiering och hur de påverkas av sjukdomen när du använder CPC isolerade från respektive sjukdomsmodeller.
Introduction
Nyligen genomförda studier stödja förekomsten av bosatta hjärt stamceller (CPC) i den vuxna däggdjur hjärta1,2,3, och CPC kan vara en användbar källa för cellterapi efter hjärt skada4, 5. Dessutom utökade CPC kan tillhandahålla en givande modell för drogkontroll och utredningen av sjukdomsmekanismer när isolerade från patienter med sällsynt kardiomyopati eller från respektive sjukdom modeller6,7.
CPC isolerade från vuxna hjärtat besitter stam/progenitor cell egenskaper1,2,3,8 som de är multipotenta, clonogenic, och har kapacitet för självförnyelse. Det finns dock många olika (under) populationer av CPC uppvisar olika surface markör profiler, inklusive, till exempel c-kit, Sca-1 och andra, eller hämtas av olika isolering tekniker (tabell 1). Flera kultur- och differentiering-protokoll har varit etablerade1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Dessa protokoll variera mestadels med avseende på tillväxtfaktor och serum innehåll, som anpassas efter syftet med odling och som kan leda till skillnader i resultat och utfall, inklusive differentiering effektivitet.
Markör-baserade isolering tekniker:
CPC kan isoleras baserat på en specifik yta markör uttryck1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Tidigare studier tyder på att c-kit och Sca-1 kan vara de bästa markörerna att isolera bosatt CPC1,11,14,19,20. Eftersom ingen av dessa markörer är verkligen specifika för CPC, är kombinationer av olika markörer vanligtvis tillämpas. Till exempel är CPC express låga nivåer av c-kit21, c-kit också uttryckt av andra celltyper, inklusive mastceller22, endotelceller23och hematopoetiska stamceller/stamceller celler24. Ett ytterligare problem är det faktum att inte alla markörer uttrycks över alla arter. Detta är fallet för Sca-1, som uttrycker i musen men inte i mänsklig25. Med hjälp av protokoll som är oberoende av isolering markörer kan därför fördelaktiga med hänsyn till kliniska prövningar och studier med humana prover.
Markör-oberoende isolering tekniker:
I området i närheten finns det flera viktiga tekniker av CPC isolering, som primärt oberoende av ytan markör uttryck, men som kan förfinas genom på varandra följande val av specifik markör-positiv och som behövs (se även tabell 1). (1) sida befolkningen (SP) teknik har ursprungligen präglats i en primitiv population av hematopoetiska stamceller som bygger på förmågan att efflux DNA färgämnet Hoechst 3334226 av ATP-bindande kassett (ABC) transportörer27. Hjärt SP celler har isolerats av olika grupper och rapporterade att uttrycka en mängd markörer med vissa smärre skillnader mellan rapporter2,8,13,14. (2) kolonibildande enhet fibroblast celler (CFU-Fs) har ursprungligen definierats baserat på en mesenkymala stromaceller cell (MSC)-som fenotyp. Isolerade MSCs är odlade på rätter att framkalla kolonin bildas. Sådan kolonibildande MSC-liknande CFU-Fs kan isoleras från vuxna hjärtat och kan differentieras till hjärt härstamningar15. (3) Cardiosphere-derived celler (CDC) är enstaka celler härstammar från kluster av celler som vuxit från vävnadsbiopsier eller explants28,29,30,31. Det visades nyligen som mestadels CD105+/CD90–/c-kit– cell bråkdel uppvisar cardiomyogenic och regenerativ potentiella32.
Här ger vi använder SP-CPC isolerade från möss, ett protokoll för effektiv induktion av endothelial härstamning baserat på en tidigare studie på råtta CPC och mus SP-CPC33. Protokollet innehåller specifika anpassningar till kulturen och expansion teknik med avseende på cell densiteten, serum innehållet i mediet och substratet. Det kan tillämpas inte bara på mus SP-systemet men att olika typer av systemet i syfte att framkalla ett öde byte från en förstärkande till en endothelial-begått CPC, vara det med tanke på transplantation av dessa celler eller deras användning för mekanistiska in vitro- studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av möss för cell isolering syfte var enligt guiden för vård och använda av försöksdjur och med schweiziska djur skydd lagen och godkändes av de schweiziska kantonala myndigheterna.
Obs: Isolering av Sca-1+/CD31– SP-systemet från mus hjärtat skedde i huvudsak som tidigare beskrivits34 med några ändringar. Material och reagens som används, se Tabell för material. För alla experiment, var hjärt SP-CPC isolerade från möss förstärks, anpassade och används i en cell linje-liknande sätt. Avsnitt 7-20 användes för denna studie.
1. vävnad förberedelse
Obs: Alla försök med möss måste utföras enligt de riktlinjer och bestämmelser. Detta protokoll används fyra möss. Kultur plattor som är 100 mm i diameter beskrivs som P100 och kultur plattor som är 60 mm i diameter beskrivs som P60 för följande delar i protokollet.
- Injicera varje mus med 200 mg/kg av pentobarbital intraperitonealt (i.p.) och vänta tills det är fullt anesthetized genom att kontrollera dess svar till tå klämmande.
- Torka av bröstet med 70% etanol. Skär hud och bröstkorgens vägg med sax för att exponera brösthålan.
- Lyfta hjärtat med pincett och skär den vid basen med sax. Sätta hjärtat i en P100 med 25 mL (5 mL för P60) kalla fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (tre till fem hjärtan per P100) eller en till två hjärtan per P60.
- Vattenpump hjärtat med pincett att mata ut blodet ur håligheter (figur 1A).
- Sätta hjärtat i en P100 med 25 mL (5 mL för P60) kalla PBS för tvätt. Ta bort atria med liten sax. Skär hjärtat i två längsgående bitar och skölj dem igen i iskall PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60).
- Överföra bitar till en ny P100 med 25 mL (5 mL för P60) kalla PBS. Skär bitar i mindre bitar med liten sax (figur 1B). Lägg en droppe av 1 mg/mL kollagenas B utspätt i Hanks balanserad saltlösning (HBSS) och finhacka de små bitarna ordentligt med en steril rakblad (figur 1 c).
2. matsmältningen
- Tillsätt 10 mL (2,5 mL för P60) 1 mg/mL kollagenas B lösningen till skålen från steg 1,6.
- Sätta kollagenas B lösningen innehållande malet hjärtat bitarna i en lutande (cirka 30°) P100 (eller P60) i en 37 ° C inkubator (figur 1 d).
- Inkubera malet hjärtat bitar för upp till 30 min; Homogenisera genom att flera gånger passera dem genom en Pasteur-pipett var 10 minut under inkubationstiden (figur 1E).
Obs: Det är viktigt att inte överskrida 30 min inkubering totalt för steg 1.3.
3. filtrering
- Tillsätt 10 mL (5 mL för P60) av kall HBSS kompletteras med 2% FBS att malet och homogeniserade hjärta bitar.
Obs: HBSS kompletteras med 2% FBS släcker kollagenas B aktivitet. - Filtrera hjärtat bitar genom 100 µm filter att ta bort osmält vävnad och centrifugera vid 470 x g under 5 minuter i rumstemperatur (RT) (figur 1F, gult filter).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 mL (3 mL för P60) röda blodkroppar lyseringsbuffert och inkubera pelleten för 5 min med enstaka skakar på is.
- Tillsätt 10 mL (5 mL för P60) PBS (för att stoppa lysis reaktionen) och filtrera provet genom en 40 µm filter att utesluta större celler, inklusive övriga hjärtmuskelceller (figur 1F, blått filter).
- Centrifugera röret på 470 x g för 5 min på RT (utan bromsar). Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL DMEM inklusive 10% FBS.
- Räkna cellerna i en alikvot med en hemocytometer. Omsuspendera cellerna med DMEM inklusive 10% FBS, som syftar till en sista cell koncentration på 1 x 106 celler/mL.
Obs: Ca 5 x 106 hjärtmuskelcellen - och erytrocyt-utarmat celler kan beräknas per mus. - Fördela cellerna i två rör (figur 2): i röret A, tillsätt 1,5 mL för Hoechst 33342 färgning med verapamil; i röret B, lägga till 18,5 mL för Hoechst 33342 färgning och fortsätt att fläcken och sortera (steg 4.1 och 4.2) hjärt SP celler av flödescytometri.
4. sortering av hjärt SP celler av flödescytometri
Obs: Verapamil hämmar Hoechst efflux genom att blockera multidrug motstånd (MDR) ABC transportör aktivitet. Hoechst 33342 är ett DNA-bindande färgämne som kan användas i levande celler för att upptäcka cellcykeln eftersom det korrelerar med det DNA-innehållet. Hoechst-33342-strängpressning celler visas i Hoechst låga delen av båda utsläpp kanaler (450 nm, Hoechst blå; 650 nm, Hoechst röd), d.v.s. undan av Hoechst-låsringen ”huvudsakliga befolkningen”, att ge dem deras namn ”sida befolkningen”. SP celler är berikad med celler med stamceller egenskaper och visa ett högt uttryck av multiresistenta ABC-transportörer (såsom MDR1 och ABCG2). Hoechst 33342 skrivs som Hoechst för följande delar i protokollet. Det är viktigt att skydda ljuskänsliga material för perfekt resultat.
-
Färgning med Hoechst i närvaro och frånvaro av verapamil
- Lägger till verapamil (med en slutlig koncentration av 83,3 µM) och Hoechst (med en slutlig koncentration på 5 µg/106 celler) i cell lösningen. För röret A, använda Verapamil och Hoechst; tube B, endast för bruk Hoechst. Inkubera i ett vattenbad (vid 37 ° C) för 90 min och återgå rören varje 20 min (figur 1 g).
- Centrifugera rören på 470 x g för 5 min på RT. Kassera supernatanten och återsuspendera varje pellet i HBSS (1 x 106 celler/mL).
- Ta en 1,5 mL alikvotens för enda infärgning och negativ kontroll från tube B (figur 2): (i) fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugerad anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-konjugerad anti-CD31; (iii) nonstained celler (negativ kontroll).
Obs: Isotypen kontroller används här för att ställa in protokollet isolering. - Centrifugrör A och B och de enda-färgning och negativ kontroll alikvoter vid 470 x g i 5 min på RT för tvättningen ute Hoechst och verapamil.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pellets av röret A och (iii) den negativa kontrollen i 250 µL HBSS och hålla dem på is i mörkret tills sortering.
- Återsuspendera pelleten i röret B i 200 µL HBSS och pelleten av (i, ii) de enda-färgning alikvoter i 100 µL av HBSS. Lägga till FITC-konjugerad anti-Sca-1 (0,6 µg/107 celler) och APC-konjugerad anti-CD31 (0,25 µg/107 celler). Inkubera pellets i 30 min på is och skaka dem från tid till annan i mörkret.
- Tillsätt 2 mL av HBSS till rören. Centrifugera rören på 470 x g för 5 min på RT.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera alla pellets med 1 mL HBSS och centrifugera som ovan. Kassera supernatanterna. Återsuspendera pelleten i singel-färgning alikvoter i 200 µL HBSS. Återsuspendera pelleten i röret B i HBSS (20 x 106 celler/mL).
- Hålla proverna på is och skyddas från ljus tills sortering.
-
Sortering med flödescytometri
- Förbereda sterila 1,5 mL sortering rör med 500 µL av HBSS inklusive 2% FBS.
- Färga celler med 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µg/106 celler) på is för 10 min att utesluta döda celler.
- Sortera hjärt SP genom att använda följande inställningar: excitera Hoechst med 350 nm (UV) excitation, samla fluorescens utsläpp med en 450/50 nm band-pass filtrera (Hoechst blå) och 670/30 nm band-passera filter (Hoechst röd) och Använd ett munstycke storlek 100 µm och trycket från 15 psi.
- För analys, spela in 5 x 105 evenemang för sortering prover och 1 x 105 evenemang för den negativa kontrollen, verapamil kontroll och singel-färgning prover.
Obs: Den hjärt SP är omkring 0,5% - 2% (figur 1 H) men kan variera mellan laboratorier och isolat. I Sca-1+/CD31– bråkdel är omkring 1% - 11% av den totala hjärt SP (figur 1I) men kan variera mellan laboratorier och isolat. SCA-1+/CD31– SP-systemet skrivs som SP-CPC för följande delar i protokollet.
5. primära kultur av isolerade SP-CPC
Obs: Användes tre olika typer av media i detta protokoll. De benämns som Medium 1 (enligt Noseda et al.) 8, medium 2, och Medium 3 och är beskrivs i Tabell av material angående deras sammansättning.
- Värma upp Medium 1 till 37 ° C före användning och kyla ner centrifugen till 4 ° C. Centrifugera sortering rören vid 4 ° C och 470 x g för 6 minuters och resuspendera cellerna i Medium 1.
- Sätta cellerna på en gas-permeable P60 maträtt med 4 mL Medium 1. Ändra på medellång varje 3 d tills cellerna har nått 70-80% sammanflödet.
Obs: Steg 5.2 kan ta cirka 2-3 veckor.
6. expansion och differentiering av SP-CPC
-
Cellkultur
- Kultur 3 x 105 SP-CPC i 8 mL Medium 1 i en T75 kolv.
- Inkubera SP-systemet vid 37 ° C med 5% CO2 fram till 70-80% confluence, ändra mediet varje 2-3 d.
Observera: Antalet cell bör ändras enligt typen av systemet används, den fördubbling tid och Cellstorlek.
-
SP-CPC tillväxt och lönsamhet under olika serumkoncentrationer
- Kultur SP-CPC för 2-3 d i T75 kolvar med 8 mL Medium 1. Noggrant aspirera på medellång och skölj försiktigt med 5 mL varm (37 ° C) HBSS.
- Behandla cellerna med 5 mL av Trypsin-EDTA för 5 min i cell inkubator, tillsätt 5 mL Medium 1 att stoppa aktiviteten Trypsin och överföra cellsuspensionen till en 15 mL tub.
- Centrifugera cellerna på 470 x g för 5 min på RT.
- Att resuspendera cellerna i Medium 1 eller Medium 2 (härstamning induktion medium) och plattan 2,5 x 105 SP-CPC på P60 rätter med 3 mL medium innehållande olika serumkoncentrationer.
- Samla in mediet från skålen av steg 6.2.4 för insamling av döda celler i en 15 mL tub efter 2 d av odling i Medium 1 eller Medium 2.
- Trypsinize vidhäftande celler som i steg 6.2.2 och samla cellsuspensionen i steg 6.2.5 15 mL tub. Centrifugera cellerna vid 840 x g i 5 min på RT.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 1 mL Medium 1 eller Medium 2 för cell inventering. Färga SP-systemet med trypan blå (0,4%) och räkna trypan blå-positiv (döda) och trypan blå-negativa (viabla) celler.
Obs: Cellernas viabilitet (steg 6.2.7) ges som trypan-blå negativa cell nummer i förhållande till den totala mobilnummer.
-
Induktion av endothelial differentiering
- Precoat en (6-brunn) kultur tallrik med 10 µg/mL laminin (LN) eller Fibronektin (FN).
- Gör ett substratlösning innehållande 10 µg/mL LN eller FN med F12 medium (eller PBS). Tillsätt 2 mL av substratlösningen i varje brunn. Upprätthålla plattan under 30 minuter vid 37 ° C.
- Sug ut lösningen från plattan och tillsätt 2 mL PBS till varje brunn till använda den.
- Aspirera på medellång från cellerna från steg 6.1.2, skölj dem försiktigt med 5 mL varm (37 ° C) HBSS, behandla dem med 5 mL av Trypsin-EDTA för 5 min i cell inkubator, tillsätt 5 mL Medium 1 att stoppa aktiviteten Trypsin och överföra cellsuspensionen till en 15 mL tub.
- Centrifugera cellerna på 470 x g för 5 min på RT. Aspirera supernatanten och Lägg till Medium 2 för cell inventering.
- Utsäde 8 x 104 celler per väl på bestruket plattan med 3 mL Medium 2 och hålla det vid 37 ° C i 20-24 h. ändra mediet för 3 mL Medium 3.
Obs: Vi rekommenderar att du använder medium innehållande en låg serumkoncentration — och utan tillägg — för första 20-24 h. Vi rekommenderar att använda < 60% cell sammanflödet (dvscell antalet steg 6.3.4 måste justeras beroende på cell storlek och tillväxt). - Odla cellerna för 21 d och ändra mediet varje 3 d.
- Kontrollera endothelial arten av differentierade celler genom färgning dem med en endothelial markör såsom von Willebrands faktor (vWF) och utför fluorescensmikroskopi.
- Tvätta cellerna med 1 mL PBS och fixa cellerna i 3,7% formaldehyd i 2 min på RT.
- Permeabilize cellerna med 0,1% Triton X i ddH2O (eller PBS) i 30 min och blockera den med 10% get serum för 1 h på RT.
- Inkubera cellerna med anti-von Willebrand faktor antikropp (1: 100) för 48 h vid 4 ° C
- Tvätta cellerna 3 x med 1 mL PBS, för 10 min varje gång. Inkubera dem med Alexa Fluor 546 get anti-kanin sekundär antikropp (1: 500) för 1 h på RT i mörkret.
- Tvätta igen 3 x, för 10 min varje, med 1 mL PBS. Färga cellkärnorna med 4'6-diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI; 1: 500) för 5 min på RT i mörkret.
- Tvätta cellerna 3 x, för 5 min varje, med 1 mL PBS. Montera cellerna och lagra dem vid 4 ° C
Obs: De culturing villkor (substrat, medium, kompletterande reagenser och FBS koncentration) steg 6.1 och 6.3 beskrivs i figur 3.
- Precoat en (6-brunn) kultur tallrik med 10 µg/mL laminin (LN) eller Fibronektin (FN).
-
Tube bildandet assay
- Förbereda en basalmembranet-matris (t.ex., Matrigel, hädanefter kallad matris) plattan.
- Tina i matrisen vid 4 ° C över natten.
- Coat en plattan med 96 brunnar med 100 µL av matrisen på is.
Obs: Det är viktigt att undvika eventuella bubblor i matrisen. Plattorna måste vara belagd på is för att undvika jellification matris. - Upprätthålla plattan vid 37 ° C i 30 min.
- Aspirera på medellång från cellerna (efter slutförandet av steg 6.3.5), försiktigt skölj cellerna med 5 mL varm (37 ° C) HBSS och behandla dem med Trypsin-EDTA för 5 min i cell inkubatorn. Lägg till Medium 3 för att stoppa aktiviteten Trypsin och överföra cellsuspensionen till en 15 mL tub.
- Centrifugera cellerna på 470 x g för 5 min på RT. Aspirera supernatanten, tillsätt 1 mL Medium 3 och Pipettera försiktigt.
- Filtrera celler med en 35 µm cell SIL, om cellerna aggregeras.
- Räkna cellerna och utsäde 2 x 103 till 4 x 103 celler i 100 µL av Medium 3 i varje matris-väl belagda. Hålla plattan vid 37 ° C i cell inkubator för 16 h.
- Ta en bild med ljusa fält Mikroskop på 2 X förstoring.
Obs: När det gäller en ofullständig trypsinization, förlänga exponeringstiden till Trypsin-EDTA till högst 7-8 min.
- Förbereda en basalmembranet-matris (t.ex., Matrigel, hädanefter kallad matris) plattan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus SP-CPC isolering:
I denna studie använde vi mus CPC isolerade enligt SP fenotypen, medan resultaten från råtta systemet ändras och lagt till från en tidigare rapport med behörighet (figur 8)33.
Cellproliferation Under hög och låg Cell tätheter och med olika serumkoncentrationer:
Vår tidigare studie visade att mRNA uttryck för hjärt lineage markörer förändrats inom de första 24 h odling steg. Det är känt att den extracellular matrisen påverkar cellen öde beslut, inklusive endothelial differentiering35. För att undersöka lämpliga villkor för underlättande av endothelial härstamning engagemang av CPC, vi använde FN och LN (båda 10 µg/mL) på en 6-well platta (tillväxtområde: 9,6 cm2/väl) i denna studie. Eftersom cellcykeln och cell öde beslut anknytas, vi söker villkoret som uppvisar en låg cellhastighet spridning i avsaknad av celldöd, som sådan ett tillstånd kan avspegla övergången från cell spridning till differentiering. Vi, därför tillämpas följande villkor och jämfört cell spridning priser: för cell densiteten, hög (80% - 90%) konfluens och låg (< 60%) confluency, och för serumkoncentration, normala odlingsbetingelser (i denna studie 3,5% FBS) och låga serum villkor (≤0.1% FBS). Först testade vi villkoret lågt densitet. Det fanns inga signifikanta skillnader av cellernas viabilitet och spridning i låg cell densiteten med 3,5% FBS mellan LN och FN, medan en låg cell densiteten med 0,1% FBS visade en minskad cellproliferation på LN jämfört FN men ingen ökad celldöd ( Figur 4). Däremot hög cell densiteten villkor, serumkoncentrationerna av både 3,5% och 0,1% visade inga skillnader i celldelning och celldöd mellan de två substratesna (figur 5).
Dessa resultat indikerar att en låg cell densiteten på LN med 0,1% serum minskar spridning utan att det påverkar CPC livskraft.
Förändringar i Cell form Endothelial differentiering medium:
Även om som kräver ytterligare studier för att förstå betydelsen och bakomliggande mekanismer, visas ändringar i formen cell vara en indikator på lämplig odlingsbetingelser som specifika ändringar kan observeras tidigt i kulturer, där endothelial differentieringen kommer att bli framgångsrik (figur 6). Som visas i de vita streckade cirklarna i figur 6, inom 7-14 d i endotel differentiering medium, innehöll framgångsrika kulturer celler som var större och annorlunda i morfologi till andra celler. Intressant, antyder dessa celler försvann mot slutet av fasen differentiering och även medverkat i lägre siffror och vid senare tidpunkter i hög densitet kulturer på LN och fotn medan vi inte ytterligare karakterisera dessa celler, detta protokoll spåra cell formen varje 2-3 d tills runt dag 14. Om inga sådana celler visas, minskas antalet celler seedade.
Utvärdering av Endothelial möjligheten med en Tube bildandet analys:
Tube bildandet analysen är en användbar teknik för att bedöma effektiviteten av endothelial differentiering av systemet genom att mäta tube bildandet kapacitet differentierade celler. Därför gjorde vi, tube bildandet analysen med celler differentieras enligt villkor som beskrivs. Intressant, visades konsekvent framgångsrika tube bildandet av celler Pläter på låg densitet och differentierade på LN, medan tube bildandet mestadels misslyckades i celler pläterade på LN på hög täthet (figur 7A). Likaså tube bildandet var mestadels misslyckade celler odlade på FN oavsett cell densiteten, men celler differentieras på FN på en låg densitet ibland bildas rudimentär rör, beroende på det cell villkoret (t.ex., isolera och/eller passagen nummer, figur 7B). För att bekräfta vad endothelial celler, var celler pläterade på coverslips åtskilt enligt protokollet beskrivs och färgas för vWF. Återigen, vWF uttrycket var mer homogena och mer uttalad i CPC differentierade på LN jämfört med FN (figur 7 cD). Figur 8 visar resultaten från tube bildandet analysen som utförs för tidigare studier med råtta CPC enligt samma protokoll som här beskrivs33. Dessa resultat visar att röret bildandet är effektivare i celler differentieras på LN jämfört med FN när klädd lågt densitet villkor och med låga serum (0,1% FBS) för 20-24 h innan differentiering i endotel differentiering medium. Dessa resultat tyder på att detta protokoll kan vara användbar för olika celltyper och oberoende av arter.
Figur 1: Illustration av specifika isolering steg för att få en hjärtmuskelcellen-utarmat cellsuspension från isolerade mus hjärtan och representativa flöde flödescytometri avläsning av den kardiella SP. (A) denna panel visar utslungning av kvarstående blod från hjärtat hålrum genom upprepade lätt tryck appliceras med hjälp av små pincett. (B) denna panel visar styckning av hjärtan i små bitar med liten sax. (C), denna panel visar den malning av hjärtat bitar med ett rakblad. (D), denna panel visar inkubering av malet hjärtan med kollagenas B i lutande plattorna vid 37 ° C. (E), denna panel visar homogenisering av malet hjärtan med Pasteur pipett under inkubation steg. (F) panelen visar filtrering av smält vävnad genom ett 100 µm filter (gul) och en 40 µm filter (blå) för avlägsnande av osmält vävnad resterna och hjärtmuskelceller. (G) i denna panel visas skonsam återföring av en 50 mL konisk tub som innehåller hjärtmuskelcellen-utarmat cellsuspensionen och inslagning i aluminiumfolie för ljusskydd efter tillsats av Hoechst. (H), denna panel visar representativa flöde flödescytometri avläsning av Hoechst-färgade celler i närvaro och frånvaro av den ABC transportör hämmaren verapamil för identifiering av den SP. (jag) i denna panel visas en representativ dot tomt på SP celler enligt CD31 och Sca-1 positivitet för identifiering av den Sca-1+/CD31– subfraction. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk översikt över den provberedning som leder upp till hjärt SP sorteringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: protokoll för endothelial härstamning induktion och differentiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: mus SP-CPC spridning när pläterade på en låg celldensitet under olika serumkoncentrationer på LN och fotn (A och B) Dessa paneler visar den cell nummer på dag 2. (C och D) Dessa paneler Visa lönsamhet på dag 2. Uppgifterna presenteras som den medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM); N = 5; olika passager; p < 0,05 av Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: mus SP-CPC spridning när pläterade på en hög celldensitet under olika serumkoncentrationer på LN och fotn (A och B) Dessa paneler visar den cell nummer på dag 2. (C och D) visar dessa paneler livskraft på dag 2. Uppgifterna presenteras som den medelvärde ± SEM; N = 5; olika passager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Cell morfologi kl 14 och 17 d under processen differentiering. Denna figur visar ljusa-fältet (BF) bilder av mus SP-CPC seedade på LN - eller FN-coated rätter med en low (låg) eller en high (hög) cell densiteten och med Medium 2 för 20 h, följt av Medium 3 för 14 eller 17 d. vit streckad cirklar Markera de områden som innehåller runda celler wit h en större Cellstorlek. Bildtagning utfördes med ljusa fält mikroskopi. Förstoringen = 2 X; skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: Tube bildandet och vWF färgning efter endothelial differentiering av SP-CPC på LN och fotn (A och B) Dessa paneler visar tube bildandet. (C och D) Dessa paneler visar vWF färgningen. Cellerna var seedade på 10 µg/mL LN - eller FN-coated rätter med en låg eller hög cell densiteten och Medium 2 för 20 h, följt av Medium 3 för 21 d, sedan skördas med Trypsin och seedade på basalmembranet matrix. Alla bilder är tagna efter 16 h. Bildtagning utfördes med ljusa fält mikroskopi och förstoringen = 2 X för paneler A och B. Bildtagning utförs med fluorescerande mikroskopi och förstoringen = 10 X för paneler C och D. Paneler A och C visar LN-belagd rätter. Paneler B och D visar FN-belagd rätter. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 8: Tube bildandet efter endothelial differentiering av råtta CPC. Rat CPC seedade på en låg cell densiteten på 10 µg/mL av LN - eller FN-coated rätter med 0,1% FBS-innehållande F12 medium för 20 h, följt av en annan 21 d i Medium 3, och sedan skördas med Trypsin. På basalmembranet matrix på en plattan med 96 brunnar, var 4 x 104 celler seedad i 100 μL av Medium 3. Bildtagning utfördes med ljusa fält mikroskopi. Förstoringen = 2 X; skalstapeln = 50 µm. Denna siffra ändras baserat på en tidigare studie33. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Arter | Isolering, identifiering markör | Referens |
| Mänskliga, råtta, mus | c-kit+/Lin-, c-kit+/CD45-, c-kit+/CD45–/CD31– | Beltrami, Cell 2003; Bolli, Lancet 2011; Ellison, Cell 2013. Smith, Nat protokoll 2014. Vicinanza, celldöd skiljer sig 2017 |
| Mongrel hundar | Lin-, plus: c-kit+, MDR1+ eller Sca-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Mus | SCA-1+ | Åh, PNAS 2003 |
| Mus | Sida befolkningen, plus: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, Sca-1+/PDGFRa+ | Hierlihy, FEBS Lett 2002; Martin, Dev Biol 2004; Pfister, Circ Res 2005; Noseda, Nat Commun 2015 |
| Mus | Kolonin bildar enheten-fibroblast, plus: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, Stem Cell Res 2012 |
| Mus, råtta, mänskliga | ISL-1+ *, plus: CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, naturen 2005; Bu, natur 2009 |
| * Isl-1 finns i embryonala eller fetala myokardiet, inte i vuxen hjärtat. | ||
Tabell 1: Isolering tekniker och markörer för hjärt stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelar med detta protokoll:
Detta protokoll ger en endothelial differentiering teknik för CPC. Vi fann att en låga serumkoncentration och låg cell densiteten kan förbättra effektiviteten av endothelial differentiering, whereby LN visade sig vara en mer lämplig substrat än FN under dessa förhållanden. Vi använde två distinkta typer av CPC: råtta CPC, som användes i en cell linje-liknande sätt, och mus SP-systemet, som var isolerad och expanderat. Särskilt, protokollet var tillämplig på båda typerna av CPC. aktuella tekniker tillåter forskare att isolera och expandera primära systemet från genetiskt modifierade möss från prekliniska sjukdomsmodeller, samt från människor28,36. Med detta protokoll på isolerade systemet kunde vara till hjälp att utredningen inte bara sjukdomsmekanismer men också att utforskningen av nya terapeutiska mål.
Systemet finns för närvarande i kliniska tester för cell terapi4,5, whereby celler är isolerade från patienter och transplanterade tillbaka efter in vitro- förstärkning. I detta avseende kunde protokollet presenteras här hjälpa till att identifiera strategier för att stärka differentiering potential av sådana före transplantation. Cellterapi lider dock fortfarande begränsad effekt på grund av låg retention, överlevnad och engraftment av transplanterade celler. Mekanistisk in vitro- studier baserade på detta protokoll eller anpassningar av dessa har potential att bidra till en bättre förståelse av de molekylära mekanismer som driver processen-modulen differentiering särskilt mekanismer relaterade till cell densiteten , substrat och tillväxtfaktorer. Ny kunskap Hämtad från sådana studier kan slutligen användas för cell omprogrammering och tillämpas för att direkt påverka bosatt systemet att differentiera efter skada.
Begränsningar i detta protokoll:
Isolerade primära CPC är heterogena populationer som visar olika fenotyper med avseende på Cellstorlek och cell tillväxttakten beroende på isoleringen, även när du använder samma markörer och identiska isolering teknik. Därför följande tre punkter måste definieras: (1) cell sådd nummer enligt Cellstorlek, (2) perfekt serumkoncentration (< 0,5%), och (3) inkubationstiden för det första steget (induktion av härstamning) med en mycket låg serumkoncentration. Här visar vi skillnader i differentiering effektivitet beroende på cell densiteten. Men även om vi jämfört låg serum (0,1% FBS) kontra kultur serumkoncentrationer (3,5% FBS), vi prövade inte andra koncentrationer inom den < 0,5% FBS utbud. Dessutom, beroende på de isolering-markörer som används och arterna, kan induktion av härstamning engagemang effektivitet variera. Protokollet bör därför optimeras för varje celltyp.
Farmakologiska och genetiska hämning/induktion tekniker kan användas för att undersöka sjukdomsmekanismer med detta protokoll, i stället för genetiskt modifierade eller animaliska sjukdomsmodeller. I det här fallet protokollet bör omformas: innan behandlingen med låg-serum-innehållande medium, cellerna kommer att behandlas med särskilda reagenser eller genetiska verktyg. Cellerna kan följaktligen vara mer sårbara än nontreated celler. Använda lågt serum i det första steget är den viktigaste punkten i detta protokoll. En försiktig validering av serum koncentration och inkubation tiden för det första steget att tillåta för att bromsa proliferation av bibehållen lönsamhet under serum frihetsberövande är därför kritiska till huruvida detta protokoll kan bli en framgång eller inte.
Sammanfattning:
Sammanfattningsvis ger isolerade systemet från djurmodeller ett värdefullt verktyg för hjärt sjukdom och förnyelse studier. Vid expansion, kan mänskliga systemet också användas direkt för cellterapi. Vi tillhandahåller här, ett protokoll för effektiv endothelial härstamning induktion och differentiering av CPC baseras på noggranna anpassningar av cell densiteten och serum koncentrationer. Fördelen med detta protokoll är dess tillämplighet på olika typer av CPC och dess potential att bidra med underlag för att studera och/eller etableringen av andra roman hjärtats förnyelse verktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Vera Lorenz för hennes bra stöd under experimenten och personalen från Flow flödescytometri anläggningen från Institutionen för biomedicin (DBM), universitet och Universitetssjukhuset Basel. Detta arbete stöds av vistelse-on track programmet från universitetet i Basel (till Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster stöds av ett bidrag från schweiziska National Science Foundation (grant nummer 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
