Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh

Summary

Hier teilen wir Methoden zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch, eine definierende Konzept der ernährungsphysiologischen Energetik und Proton Leck, die primäre Ursache der Ineffizienz im mitochondrialen Erzeugung von ATP. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie verloren Nährstoff Auslastung zu helfen, mitochondriale Funktion ausgewertet werden soll.

Abstract

Sauerstoffverbrauch, Proton Motive force (PMF) und Proton Leck sind Messungen der mitochondrialen Atmung, oder wie gut Mitochondrien ATP NADH und FADH umsetzen können. Da Mitochondrien auch der primäre Standort für Sauerstoff und Nährstoff Oxidation zu Kohlendioxid und Wasser, wie effizient sie Sauerstoff und produzieren ATP direkt bezieht sich auf die Effizienz der Nährstoff Stoffwechsel Nährstoffbedarf des Tieres, und Gesundheit des Tieres. Der Zweck dieser Methode ist es, mitochondriale Atmung zu untersuchen, die verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Medikamente, Ernährung und Umwelteinflüsse auf mitochondrialen Stoffwechsel untersuchen. Die Ergebnisse enthalten Sauerstoffverbrauch gemessen als Proton abhängigen Atmung (Zustand 3) und Proton Leck abhängigen Atmung (Zustand 4). Das Verhältnis von Staat 3 / staatliche 4 Atmung ist definiert als Atmungskontrolle Verhältnis (RCR) und mitochondriale energetischen Effizienz darstellen kann. Mitochondriale Proton Leck ist ein Prozess, der Ableitung der mitochondrialen Membranpotentials (MMP) ermöglicht durch abkoppeln Oxidative Phosphorylierung von ADP verringern die Effizienz der ATP-Synthese. Sauerstoff und TRMP + empfindliche Elektroden mit mitochondrialen Substrate und Elektronentransport-Kette-Inhibitoren sind zur Messung der Status 3 und Staat 4 Atmung, Mitochondrien-Membran PMF (oder das Potenzial um ATP zu produzieren) und Proton Leck. Einschränkungen dieser Methode sind, dass Lebergewebe so frisch wie möglich sein muss und alle Biopsien und Assays in weniger als 10 h durchgeführt werden müssen. Dies schränkt die Anzahl der Samples, die gesammelt und von einer einzigen Person an einem Tag etwa 5 verarbeitet werden kann. Nur 1 g des Lebergewebes ist jedoch erforderlich, damit in große Tiere wie Milchkühe, die Menge der Probe erforderlich klein im Verhältnis Leber ist und es wenig Erholungszeit benötigt gibt.

Introduction

Mitochondrien sind sehr empfindlich auf stress und ihre zelluläre Umgebung kann dazu beitragen, eine Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen. Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck in den Mitochondrien sind Indikatoren für die Gesundheit der Mitochondrien. In diesem Papier Schätzung mitochondriale Energieeffizienz mit RCR beschriebenen Methoden basierend auf Sauerstoffverbrauch mit und ohne Proton Leck. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie in Nährstoff Auslastung¹verloren. Änderungen im Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck erkennen mitochondriale Dysfunktion zur Stoffwechselerkrankung und führt zu verminderter Energie-Effizienz. Diese Methoden können auch verwendet werden, die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf die mitochondriale Atmung prüfen. Das übergeordnete Ziel der Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik ist Funktion der Mitochondrien und energetische Effizienz zu bewerten.

Hepatischen mitochondrialen Dysfunktion wurde mit mehreren Krankheiten bei Milchkühen. Die Fähigkeit des Zellstoffwechsels, wechseln zwischen Kohlenhydrat- und Lipid Kraftstoffe konfrontiert mit einem Energiedefizit in frühen Laktation ist durch die Anzahl und Funktion von Mitochondrien in der Zelle²beeinflusst. Mängel in der Fähigkeit der Mitochondrien zur Anpassung an eine erhöhte Nachfrage nach Energie und erhöhter β-Oxidation führt zu einer Akkumulation von intrazellulären Lipid mit Insulinresistenz verbunden und führen zur Bildung von Fettleber in frühen Laktation Milchkühe. Mitochondrien, können als Ort der Keton-Körper Produktion und Gebrauch, eine Schlüsselrolle in Ketose Milchkühe³spielen. Ein Mangel an Mitochondrien oder mitochondriale Dysfunktion wirken sich Kraftstoff Verfügbarkeit an die Peripherie und in Änderungen der Sauerstoffverbrauch oder RCR niederschlagen.

Mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Veränderungen in Reaktion auf eine Entzündung. Sieben Tage alte Masthähnchen wurden randomisiert in eine Gruppe mit Eimeria Maxima und eine Kontrolle Gruppe⁴infiziert. Masthähnchen, die nicht Kokzidiose Herausforderung unterziehen hatte geringeren Sauerstoffverbrauch durch Proton Leck und höhere RCR darauf hinweist, dass Leber Mitochondrien durch zunehmende Proton Leck auf eine immun Herausforderung zu reagieren. Während Proton Leck und reaktive Spezies Sauerstoffproduktion galt einst als ein Zeichen der Mitochondrien-Membran Dysfunktion und schädlich für Energieeffizienz, jetzt ist es bekannt, dass es wichtig für den Import von Proteinen und Kalzium in Mitochondrien⁵ , und für die Erzeugung von Wärme¹.

Elektron Leck aus der Atmungskette macht Mitochondrien anfällig reaktiven Sauerstoff-Spezies-Produktion und oxidative Schäden an Mitochondrien-Membranproteine, Lipide und mitochondriale DNA. Zunehmendem Alter der Mitochondrien Schäden vor allem an MtDNA verursacht weitere Dysfunktion in den mitochondrialen Stoffwechsel⁶ und höhere Krankheitsanfälligkeit der Kuh ansammeln kann. In der Praxis fließen viele Nutztiere hohe Zuschläge wie Cu, Zn und Mn antioxidative Funktion zu steigern. Allerdings Fütterung hohe Cu, Zn und Mn verringerte Milchproduktion und erhöhten Sauerstoffverbrauch durch Proton Leck (Zustand 4 Atmung)⁷.

Frühere Untersuchungen über die Rolle der mitochondrialen Funktion im Bereich der Energieeffizienz bei Rindern konzentriert sich auf Veränderungen in der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck. Nur wenige Studien bei Milchkühen veröffentlicht wurden und die meisten Zeitungen vergleichen Produktionseffizienz in Form von Rest-Futteraufnahme (RFI), mitochondriale Funktion in Rinder. Variabilität in der mitochondrialen Atmung, die Preise untersucht wurden, durch Messung von Zustand 3, Stand 4 und RCR in Lebern von stillenden Holstein-Kühen und laktierenden Rind Rinder (Brangus, Angus und Hereford)⁸. Die Forscher fanden keinen Zusammenhang in der mitochondrialen Atmung mit Wachstum oder Melken Merkmale für Rinder aber eine Korrelation zwischen mitochondriale Atmung und Melken Merkmale für Holsteins gemeldet. In zwei Studien wurde RFI in Rinder, mitochondriale Atmung Preise (Zustand 3, Stand 4 und RCR) im Muskel Mitochondrien^9,10verglichen. Mitochondriale Atmung Preise geändert in Reaktion auf DMI und niedrige Preise wurden weniger effizient Rindfleisch Ochsen zugeordnet. In einer weiteren Studie wurden RFI Ochsen von hohen oder niedrigen RFI Bulls mit mitochondrialen Atmung und Proton Leck Kinetik zwischen den beiden Gruppen von Nachkommen¹¹verglichen. Unterschiede wurden durch Gewinn bestätigt wird, dass die Schlussfolgerung, die gewinnen nicht Auswirkungen mitochondriale Atmung in Rinder hat.

In diesem Papier ein Experiment untersucht Leber RCR als Reaktion auf die Verfütterung von 3 Antioxidans Mineralien an laktierenden Milchkühen die Verwendung von Methoden zur Messung veranschaulicht Sauerstoffverbrauch während Zustand 4 und 3 Atmung und PMF.

Protocol

Alle Methoden, Protokoll und hier beschriebenen Studien stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of California, Davis. (1) erhalten eine Leberbiopsie aus einer Milchkuh Holstein Hinweis: Eine Leberbiopsie sollte von einem zugelassenen Tierarzt durchgeführt werden. Leberbiopsien können auf der Molkerei Website durchgeführt werden, wo die Kühe befinden. Laktierenden Milchkühe können weiterhin normalerweise gemolken…

Representative Results

Positive Ergebnisse zeigen RCR und Proton Leck Kinetik sind in Tabelle 1 und Abbildung 15, bzw. gezeigt. In dieser Studie7, RCR und Protein-Leck Kinetik wurden gemessen in Holstein Kühe mit 70 Tagen in Milch nach Kühe 1 5 unterschiedliche Niveaus der Cu, Zn und Mn für 28 Tage gefüttert worden war. Zustand 4, maximale Proton Leck-abhängige Atmung, hatten eine Tendenz zu Mineralienaufnahme von Cu, Mn und Zn (p <…

Discussion

Die kritischsten Punkt im Protokoll ist eine repräsentative Lebergewebe Probe zu erhalten und beginnt die Isolation der Mitochondrien so bald wie möglich nach der Biopsie. Variation in Atmung Messungen ist niedrig (Tabelle 1) durch eine kurze Transportzeit von Kuh ins Labor. Um Verkehr zu reduzieren, wurde ein kleines Labor eingerichtet im Büro der Molkerei und Leber Proben wurden auf der Büro-Labor getrieben, wie jeder gesammelt wurde, so dass Mitochondrien innerhalb 10 min der Biopsie isoliert wurd…

Materials

Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Suture	Fisher Scientific	19-037-516
Suture needles	NA	NA	Included with Suture
Scalpels	Sigma – Aldrich	S2896 / S2646	# for handle and blades
Surgery towels	Fisher Scientific	50-129-6667
Falcon tubes 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Tweezers	Sigma – Aldrich	Z168750
50 mL syringes	Fisher Scientific	22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Cow halter	Tractor Supply Co.	101966599
Cotton swabbing	Fisher Scientific	14-959-102
cotton gauze squares (4×4)	Fisher Scientific	22-246069
Medical scissors	Sigma – Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow			Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine			Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days			Provided by Veterinarian
Providone Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Ethanol 70%	Sigma – Aldrich	793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight			Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)			Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine			Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance	Fisher Scientific	02-911-527
Homogenizer Motor	Cole Parmer	EW-04369-10
Homogenizer Probe	Cole Parmer	EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice	Fisher Scientific	FB100600
Refrigerated microfuge	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)	abcam	ab102536
Sucrose	Sigma – Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma – Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma – Aldrich	EDS-1KG
BSA (fatty acid free)	Sigma – Aldrich	A7030-50G
Mannitol	Sigma – Aldrich	M4125-1KG
Deionized water	Sigma – Aldrich	38796
Hepes	Sigma – Aldrich	H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode	Hansatech (PP Systems)	OXY1
Thermoregulated Water Pump	ADInstruments	MLE2001
Clark type Oxygen electrode	NA	NA
Autopipette (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Included with Oxy1
Small magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-95
Micropipette (10 μL)	Cole Parmer	SK-21600-60
pH meter	VWR
Chemicals
KCl	Sigma – Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma – Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma – Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma – Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma – Aldrich	E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)	Sigma – Aldrich	R8875-5G
Succinate (1 M solution)	Sigma – Aldrich	S3674-250G
ADP (100 mM solution)	Sigma – Aldrich	A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)	Sigma – Aldrich	75351
FCCP	Sigma – Aldrich	C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)	Sigma – Aldrich	M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma – Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma – Aldrich	N7143
FCCP	Sigma – Aldrich	C3920
TPMP	Sigma – Aldrich	T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA