Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.
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Artigo de método
Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein
Neste artigo
Resumo
Resumo
Consumo de oxigênio, prótons força (PMF) e vazamento de próton são medidas da respiração mitocondrial, ou quão bem as mitocôndrias são capazes de converter o NADH e DANIII em ATP. Desde que as mitocôndrias são também o local principal para o uso de oxigênio e nutriente oxidação de dióxido de carbono e água, quanto à eficácia, eles usam o oxigênio e produzem ATP diretamente se relaciona com a eficiência do metabolismo de nutrientes, as necessidades de nutrientes do animal, e saúde do animal. A finalidade desse método é examinar a respiração mitocondrial, que pode ser usada para examinar os efeitos das diferentes drogas, dietas e os efeitos ambientais sobre o metabolismo mitocondrial. Os resultados incluem o consumo de oxigênio, medido como respiração dependente de próton (estado 3) e respiração dependente do vazamento próton (estado 4). A relação da respiração estado 4 3 / estado é definida como índice de controlo respiratório (ICR) e pode representar a eficiência energética mitocondrial. Vazamento de próton mitocondrial é um processo que permite a dissipação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) desacoplamento fosforilação oxidativa do ADP, diminuindo a eficiência da síntese de ATP. Oxigênio e TRMP + eletrodos sensíveis com substratos mitocondriais e inibidores da cadeia de transporte de elétrons são usados para medir o estado 3 e 4 do estado respiração, membrana mitocondrial PMF (ou o potencial para produzir ATP) e vazamento de próton. Limitações para este método são que o tecido do fígado deve ser tão fresco quanto possível e todas as biópsias e ensaios devem ser realizados em menos de 10 h. Isso limita o número de amostras que podem ser recolhidos e tratados por uma única pessoa de um dia para aproximadamente 5. No entanto, é necessário apenas 1 g de tecido hepático, então em grandes animais, como gado leiteiro, a quantidade de amostra necessária é pequena em relação ao tamanho do fígado e há pouco tempo de recuperação necessário.
Introdução
As mitocôndrias são muito sensíveis ao estresse e seu ambiente celular pode contribuir para uma ampla variedade de doenças metabólicas. Consumo de oxigênio e vazamento de prótons na mitocôndria são indicadores de saúde de mitocôndrias. Os métodos descritos neste papel estimativa mitocondrial eficiência de energia usando RCR baseiam no consumo de oxigênio, com e sem vazamento de próton. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes1. Mudanças no consumo e próton vazamento de oxigênio podem identificar a disfunção mitocondrial, o que contribui para doenças metabólicas e resulta em eficiência energética dimi....
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Protocolo
Todos os métodos, protocolo e estudos aqui descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis.
1. a obtenção de uma biópsia do fígado de uma vaca leiteira de Holstein
Nota: Uma biópsia do fígado deve ser realizada por um veterinário licenciado. Biópsias do fígado podem ser executadas no site onde se situam as vacas leiteiro. Vacas leiteiras em lactação podem continuar a ser ordenhada normalmente e leite não precisa ser retirada da fonte de alimentos antes ou após o procedimento. É recomendável que pelo menos 4 pessoas são necessários ....
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Resultados
Resultados positivos, mostrando a cinética de vazamento RCR e prótons são mostrados na tabela 1 e Figura 15, respectivamente. No presente estudo7, RCR e proteína vazamento cinética foram medidos em vacas leiteiras Holstein em 70 dias no leite depois que as vacas tinham sido alimentadas 1 dos 5 níveis diferentes de Cu, Zn e Mn por 28 dias. Estado 4, respiração de vazamento-dependente de próton máximo, tinha uma tendênci.......
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Discussão
O ponto mais crítico no protocolo é obter uma amostra representativa de tecido hepático e começando o isolamento da mitocôndria, logo que possível após a biópsia. Variação nas medições de respiração é baixa (tabela 1) devido a um tempo de transporte curto de vaca para laboratório. Para reduzir o tempo de transporte, foi instituído um pequeno laboratório no escritório da leiteria, e amostras de fígado foram levadas para o laboratório de escritório como cada uma foi coletada para que as mitocôndrias foram .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela Alltech e USDA Hatch fundos através do centro de Sanidade Animal de comida na UC Davis School de medicina veterinária.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Biópsia hepática | |||
| Equipamento | |||
| Instrumento de biópsia de fígado bovino Schackelford-Courtney | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Sutura | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Agulhas de sutura | NA | NA | Incluídas com Sutura |
| Bisturis | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # para cabo e lâminas |
| Toalhas de cirurgia | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Tubos de falcão 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Pinças | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| Seringas de 50 mL | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Agulhas de injeção (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | ||
| Algodão | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| quadrados de gaze de algodão (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Tesoura médica | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Fornecido por Vacina | ||
| Clostridia | Fornecida pelo Veterinário | ||
| Antibióticos de biópsia hepática excenel 2 cc/100 lbs por 3 dias | Fornecido pelo Veterinário | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Etanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Cloridrato de xilazina 100 mg/mL IV a 0,010-0,015 mg/kg peso | Fornecido pelo veterinário | ||
| 2% de lidocaína HCl (10-15 mL) | Fornecido pelo veterinário | ||
| 1 mg/kg IV injeção de flunixina meglumina | Fornecido pelo veterinário | ||
| Isolamento de mitocôndrias (fígado) | |||
| Equipamento | |||
| Frasco Wheaton 30 mL com um pilão de Teflon de 0,16 mm de folga | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Motor Homogeneizador | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Sonda Homogeneizadora | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Pipeta Automática (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Copo (500 mL) com gelo | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Microfuga refrigerada | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Tubos de microfuga (1,5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| ChemicalsKit de | |||
| ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) (microplacas para leitor de placas) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (livre de ácidos graxos) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Manitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Água deionizada | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use para criar meios de isolamento de mitocôndrias: 220 mM de manitol, 70 mM de sacarose, 20 mM de HEPES, 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA e 0,1% (p/v) de BSA livre de ácidos graxos pH 7,4 a 4 C, durará 2 dias em geladeira | |||
| Consumo de oxigênio mitocondrial< / forte> | |||
| Equipamento< / forte> | |||
| Configuração do oxígrafo + eletrodo de oxigênio tipo Clark | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| ADInstruments | MLE2001 | ||
| Eletrodo de oxigênio tipo Clark | NA | NA | |
| Autopipeta (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Incluído com Oxy1 |
| Pequena barra de agitação magnética | Micropipeta Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| (10 μ L) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| medidor de pH | VWR | ||
| strong>Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use para fazer meios de consumo de oxigênio mitocondrial: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA, pH 7,4 a 30 ° C com 0,3% de rotenona BSA | |||
| (solução de 4 mM) | Sigma - Succinato | Aldrich R8875-5G | |
| (solução de 1 M) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (solução de 100 mM) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomicina (solução de 8 μ g/mL em etanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Potencial de membrana mitocondrial e força motriz de prótons< | |||
| strong>Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions não precisam ser frescas, mas precisam ser mantidas em um freezer entre as execuções | |||
| Malonate (solução de 0,1 mM) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomicina (8 μ g/mL em etanol), manter em freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL em etanol), manter em freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solução: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA, pH 7,4 a 30 & C com BSA |
Referências
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica ....
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Reimpressões e permissões
