Summary
Qui, descriviamo 3 modelli di lesione di zebrafish adulto e loro uso combinato con il trattamento di droga immunosopressiva. Siamo fornire indicazioni su formazione immagine di rigenerare i tessuti e il rilevamento di mineralizzazione dell'osso in esso.
Abstract
Zebrafish sono in grado di rigenerare i vari organi, tra cui appendici (pinne) dopo l'amputazione. Ciò comporta la rigenerazione dell'osso, che ricresce entro circa due settimane dopo la ferita. Inoltre, zebrafish sono in grado di guarire rapidamente dell'osso dopo la trapanazione del cranio e riparare le fratture che possono essere facilmente introdotto nei raggi della pinna ossuta di zebrafish. Queste analisi di lesioni rappresentano fattibile paradigmi sperimentali per testare l'effetto dei farmaci somministrati su rapidamente formando dell'osso. Qui, descriviamo l'uso di questi modelli di 3 lesioni e loro uso combinato con il trattamento glucocorticoide sistemica, che esercita gli effetti immunosopressivi ed inibitoria dell'osso. Forniamo un flusso di lavoro su come prepararsi per il trattamento immunosopressivo in zebrafish adulto, illustrano come eseguire pinna amputazione, trapanazione delle ossa calvarial e fratture pinna e descrivere come l'uso di glucocorticoidi influenzano entrambi osso formazione osteoblasti e cellule della linea monocito/macrofago come parte dell'immunità innata nel tessuto osseo.
Introduction
Zebrafish rappresentano un potente modello animale per studiare la malattia e lo sviluppo dei vertebrati. Questo è dovuto al fatto che essi sono piccoli animali che si riproducono molto bene e che il loro genoma è completamente sequenziato e suscettibili di manipolazione1. Altri vantaggi includono la possibilità di eseguire imaging continuato dal vivo in diverse fasi, compreso formazione immagine in vivo di zebrafish adulto2e la possibilità di eseguire gli schermi della droga a resa elevata in zebrafish larve3. Inoltre, zebrafish possiedono un'elevata capacità rigenerativa in una varietà di organi e tessuti tra cui osso e così servire come un sistema utile per studiare la malattia scheletrica e riparare4,5.
Osteoporosi indotta da glucocorticoidi (GIO) è una malattia che deriva dal trattamento a lungo termine con glucocorticoidi, ad esempio nel corso del trattamento di malattia autoimmune come l'asma o l'artrite reumatoide. GIO si sviluppa in circa il 30% dei pazienti trattati con glucocorticoidi e rappresenta un problema sanitario importante6; Pertanto, è importante studiare l'impatto di immunosoppressione sul tessuto osseo in grande dettaglio. Negli ultimi anni sono stati sviluppati vari modelli di zebrafish a che fare con la patogenesi di GIO. Perdita dell'osso glucocorticoide-mediata è stata indotta in larve di zebrafish, ad esempio, che ha portato all'identificazione di composti contromisure aumentando la massa di una droga schermo7. Inoltre, gli effetti inibitori dell'osso indotta da glucocorticoidi hanno stati imitati in zebrafish scale sia in vitro che in vivo8,9. Queste analisi sono molto convincenti approcci, soprattutto quando si tratta per l'identificazione di nuovi farmaci immunosoppressivi e osso anabolizzanti. Tuttavia, solo in parte prendono in considerazione l'endoscheletro e non sono stati eseguiti in un contesto rigenerativo. Pertanto, non consentono l'indagine degli effetti glucocorticoide-mediata durante rapida modalità di formazione dell'osso adulto, rigenerativa.
Qui, presentiamo un protocollo che consente ai ricercatori di studiare glucocorticoide-mediata effetti sulle ossa di zebrafish adulto in fase di rigenerazione. Modelli di lesione includono l'amputazione parziale della pinna caudale zebrafish, trapanazione del cranio, così come la creazione delle fratture di pinna ray (Figura 1A-1 C) e sono combinati con glucocorticoidi esposizione tramite incubazione (Figura 1E ). Abbiamo recentemente utilizzato una parte del presente protocollo per descrivere le conseguenze dell'esposizione al prednisolone, uno dei farmaci comunemente prescritti del corticosteroide, il zebrafish adulto rigenerante pinna e cranio osseo10. In zebrafish, gestione di prednisolone porta alla proliferazione degli osteoblasti in diminuzione, differenziazione degli osteoblasti incompleta e rapida induzione dell'apoptosi nel lignaggio del monocito/macrofago10. In questo protocollo, descriviamo anche come fratture possono essere introdotta nella singola aletta ossuta ray segmenti11, come questo approccio può essere utile quando si studia glucocorticoide-mediata effetti sull'osso che si verificano durante la riparazione di frattura. I metodi presentati qui contribuiranno all'ulteriore indirizzo base dei meccanismi di azione glucocorticoide in rapida rigenerazione dell'osso e possono essere impiegati anche in altri contesti sistemica di somministrazione del farmaco nel contesto della rigenerazione dei tessuti di zebrafish.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Landesdirektion di Dresda (permesso di numeri: AZ D 24-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. preparazione dei materiali e delle soluzioni
Nota: Prednisolone, come altri glucocorticoidi, conduce all'immunosoppressione. Così, precauzione deve essere presa per prevenire l'infezione negli animali trattati durante l'esperimento. A tal fine, articoli di vetro di autoclave e 'acqua di pesce' (cioè, l'acqua che viene utilizzata per posteriore zebrafish adulto) prima di iniziare l'esperimento.
- Calcolare il numero di zebrafish per essere utilizzato nell'esperimento. Assicurarsi di includere gli individui che fungono da controlli.
- Coppe di vetro autoclave 600 mL che sono coperti con foglio di alluminio con nastro autoclave. Zebrafish sarà trattato singolarmente, quindi 1 bicchiere è richiesto per zebrafish.
- Calcolare la quantità di pesci di acqua necessaria per l'esperimento. 300 mL sono richiesti per persona al giorno. Prendere in considerazione la durata dell'esperimento (ad es., 1 settimana/7 giorni).
- Riempire le bottiglie di vetro con pesci d'acqua, chiudere loro ed autoclave le bottiglie con nastro autoclave. Idealmente, usare bottiglie da 2 litri, ma altre bottiglie come L 1 o 5 L possono essere usate pure.
Nota: Se gli esperimenti sono lunghi (ad es., 4 settimane/28 giorni) e la quantità di bottiglie di vetro è limitata, assicurarsi di preparare bottiglie per un minimo di parecchi giorni alla volta e ripetere il processo (1.3-1.4) in tutto l'esperimento. - Preparare una soluzione stock di prednisolone di prednisolone sterile filtrata 100 mM in dimetilsulfossido (DMSO). Congelare il brodo in 1 mL o aliquote di tubo del microcentrifuge 2 mL.
Attenzione: Sempre indossare indumenti di protezione quando lavorano con il prednisolone (guanti, occhiali protettivi, camice da laboratorio). - Il primo giorno dell'esperimento, preparare soluzioni di incubazione con il prednisolone e DMSO, rispettivamente. A tal fine, scongelare la quantità necessaria di soluzione stock di prednisolone 100 mM e aggiungere prednisolone pesce in autoclave acqua ad una concentrazione finale di 50 µM.
- Per i trattamenti di controllo, aggiungere il volume corrispondente di DMSO per acqua pesci in autoclave. Ad esempio, per produrre acqua di 2L prednisolone contenenti pesci, aggiungere 1 mL di brodo di prednisolone 100 mM a 2 L di acqua di pesce. In un'altra bottiglia di 2 L di acqua di pesce, aggiungere 1 mL di DMSO, corrispondentemente.
- Lavorare in un luogo appropriato designato per eseguire trattamenti farmacologici, idealmente in una stanza a 27 ° C.
2. generazione delle lesioni in Zebrafish pinne
Nota: Per ferire osso in zebrafish pinne, effettuare la resezione della pinna (amputazione, solitamente nella pinna caudale) o frattura raggi della pinna ossuta individuali (modello di frattura). A tal fine anestetizzare zebrafish adulto prima.
- Amputazione
- Per anestetizzare zebrafish adulto, preparare un diametro di 100 mm di Petri contenente 0,02% MS-222 (etil-3-aminobenzoato methanesulfonate) in acqua di pesci (quest'acqua non deve necessariamente essere sterilizzato nell'autoclave).
- Trasferire uno zebrafish alla volta di Petri contenente MS-222 utilizzando una rete dei pesci e incubare finché giace su un fianco senza movimento e non risponde al tocco. Prova a quest'ultimo toccando la pinna anale con il forcipe smussato.
- Attendere finché non viene raggiunto il livello 4 di anestesia che è il livello appropriato per pinna resezione12. In questa fase, il tasso di movimento opercular è diminuito, tono muscolare viene perso e il pesce non si muove su touch12.
- Prendere forcipe smussato e trasferimento zebrafish anestetizzati con attenzione al coperchio inversed di 100mm di Petri. Mettere il pesce zebra sul lato laterale. Assicurarsi che il pesce zebra mentono sempre lo stesso orientamento, ad esempio sul loro lato destro del corpo. Con un bisturi o una lametta, resecare il 50% della pinna (Figura 1A, 2A).
Nota: La velocità di rigenerazione di zebrafish pinna dipende dalla quantità di tessuto resecato pinna, vale a dire, l'altro tessuto di pinna è resecato, il più veloce la pinna Rigenera13. Così, per ridurre al minimo variazioni nella rigenerazione di pinna assicurarsi sempre resecare la pinna allo stesso livello in tutti i zebrafish. - Trasferimento zebrafish feriti a un bicchiere di vetro sterilizzati nell'autoclave contenente mL 300 di prednisolone o DMSO contenente acqua pesci in autoclave. Coprire il becher di vetro con carta stagnola per evitare la fuga di zebrafish.
- Ripetere i passaggi 2.1.2 a 2.1.3 è raggiunto il numero richiesto di zebrafish per l'esperimento.
- Per anestetizzare zebrafish adulto, preparare un diametro di 100 mm di Petri contenente 0,02% MS-222 (etil-3-aminobenzoato methanesulfonate) in acqua di pesci (quest'acqua non deve necessariamente essere sterilizzato nell'autoclave).
- Frattura di pinna
- Preparare un 100mm rivestite su agarosio di Petri riscaldando una soluzione di agarosio 2% in acqua di pesci o E3 (media embrione 3, 50 mM di cloruro di sodio, cloruro di potassio 0,17 mM, 0,33 mM di cloruro di calcio, solfato di magnesio di 0,33 mM). Attentamente, versare circa 10 – 15 mL della soluzione di Petri. Il fondo del piatto dovrebbe essere completamente coperta. Lasciate che l'agarosio solidificare.
- Anestetizzare zebrafish come descritto nella sezione 2.1.
- Prendere il forcipe smussato e trasferimento zebrafish anestetizzati con attenzione per il 100mm rivestite su agarosio di Petri. Mettere il pesce zebra sul lato laterale. Sotto il microscopio di dissezione, diffondere la pinna caudale completamente per essere in grado di identificare i raggi della pinna ossuta distinti e pinna segmenti di ray. Assicurarsi che il pesce zebra mentono sempre lo stesso orientamento, ad esempio sul loro lato destro del corpo.
- Con un ago per iniezione (0,3 mm x 13 mm) introdurre una frattura al centro di un segmento di ray ossuta pinna (Figura 1B). Per effettuare questa operazione, l'ago viene inserito leggermente il segmento fino a quando appare una crepa (freccia in Figura 2B). Mentre leggera pressione conduce alla frattura di uno solo dei due hemirays avversaria più forte pressione porterà alla frattura di entrambi i segmenti hemiray.
- Non introdurre troppi fratture nelle pinne, poiché questo comprometterà notevolmente la stabilità della pinna. Come suggerimento, si applicano le fratture solo in 3 a 5 raggi della pinna.
- Sempre produrre fratture in segmenti corrispondenti tra raggi della pinna differenti e zebrafish, per esempio in raggi della pinna dorsale 3, 7 (o 8) e pinna ventrale ray 3. Il livello prossimale-distale della frattura è ideale a 3 segmenti prossimali biforcazione punto 11 dei raggi della pinna.
- Trasferimento zebrafish feriti a un bicchiere di vetro sterilizzati nell'autoclave contenente mL 300 di prednisolone o DMSO contenente acqua pesci in autoclave. Coprire il becher di vetro con carta stagnola per evitare la fuga di zebrafish.
- Ripetere i passaggi 2.2.2 a 2.2.5 è raggiunto il numero richiesto di zebrafish per l'esperimento.
3. generazione di lesioni Calvarial del cranio (Trepanation)
Nota: Il calvariae in zebrafish sono omologhi ai ossa calvarial nei mammiferi. Così, queste ossa esoscheletrica14 rappresentano un tessuto di particolare interesse nello studio della patogenesi di GIO. Per ferire il cranio, trapanazione viene eseguita da un foro frontale Os e/o Os parietale (Figura 1, 2C) con l'aiuto di un microdrill11.
- Anestetizzare zebrafish conformemente al punto 2.1.
- Tenere il zebrafish anestetizzati in posizione verticale con il forcipe, cosicché le ossa calvarial sono ben visibili sotto un microscopio di dissezione dall'alto (Figura 1).
- Individuare il microdrill rotante al centro dell'osso frontale (Os frontale) e toccare l'osso. Il foro prodotto è della dimensione microdrill Burr (500 µm, Figura 2, Figura 3B).
Nota: Assicurarsi di non spostare il microdrill lateralmente, producendo le lesioni. Inoltre arresta immediatamente quando scende improvvisamente la resistenza dell'osso. Non praticare qualsiasi ulteriormente, altrimenti il cervello sarà danneggiato 15. - Trasferimento zebrafish feriti in una gabbia riempita con acqua di pesce fino a quando si recupera completamente dall'anestesia. Guardate attentamente.
- Trasferire l'infortunato zebrafish per un pesce di acqua plus prednisolone o bicchiere di vetro contenente DMSO.
4. trattamento di Zebrafish durante l'incubazione
Nota: Durante l'applicazione di prednisolone/DMSO, il farmaco contenente acqua di pesce deve essere cambiata ogni giorno, e zebrafish devono essere alimentati regolarmente.
- Cambi d'acqua
- Per scambiare l'acqua di pesce, scongelare stock prednisolone 100 mM e preparare la quantità necessaria di prednisolone µM 50 nei pesci in autoclave acqua dolce ogni giorno del periodo di trattamento. Preparare il DMSO contenente acqua di pesce per il controllo di zebrafish di conseguenza.
- Prendere un bicchiere di vetro contenente un singolo zebrafish alloggiata nella sua soluzione di incubazione e trasferire la soluzione tra cui zebrafish in un apposito contenitore, ad esempio una gabbia di alloggiamento temporale.
Nota: Sempre uso contenitori intermedi separati per prednisolone e DMSO trattata zebrafish, rispettivamente, per assicurarsi DMSO controllo zebrafish non vengono esposti al prednisolone e viceversa. - Riempire il bicchiere di vetro con fresco farmaco contenente pesce acqua (300 mL).
- Consente di trasferire il bicchiere di vetro contenente soluzione di incubazione fresco utilizzando un netto di pesce zebrafish dal contenitore intermedio. Rimettere la pellicola per evitare la fuga di zebrafish.
- Se il tempo dell'esperimento supera 2 settimane, scambiare i bicchieri di vetro.
- Alimentazione
- Durante i trattamenti brevi (per fino a 2 giorni) non si nutrono di zebrafish. Durante gli esperimenti più a lungo, alimentazione zebrafish. Prestare particolare attenzione per evitare l'inquinamento della soluzione incubazione. Così, alimentare con Artemia SSP. , piuttosto che con mangime in fiocchi e solo su ogni secondo giorno.
Nota: Artemia vengono regolarmente utilizzati per nutrire il giovane zebrafish e dovrebbe essere disponibile nell'unità inamidata zebrafish.- Circa 2 h prima di acqua i pesci vengono scambiati, mangimi zebrafish con Artemia ssp in loro bicchieri di vetro. A tale scopo, utilizzare una pipetta di plastica e avanzamento 0,5-1 mL di soluzione di Artemia tratteggiato per bicchiere di vetro.
- Attendere per 2 h e scambiare la soluzione di incubazione con fresco farmaco contenente acqua di pesce secondo il paragrafo 4.1.
- Durante i trattamenti brevi (per fino a 2 giorni) non si nutrono di zebrafish. Durante gli esperimenti più a lungo, alimentazione zebrafish. Prestare particolare attenzione per evitare l'inquinamento della soluzione incubazione. Così, alimentare con Artemia SSP. , piuttosto che con mangime in fiocchi e solo su ogni secondo giorno.
5. analisi dei campioni
Nota: Dopo l'incubazione di zebrafish feriti in prednisolone e DMSO contenente acqua di pesce, rispettivamente, eseguire analisi di mineralizzazione/calcificazione dell'osso (5.1 a 5.3) o effettuare live imaging di zebrafish sotto il microscopio di dissezione (5.4) 10,11,16. Utilizzare live imaging per determinare lunghezza rigenera pinna e per rilevare le differenze nell'espressione del gene reporter in zebrafish transgenici.
-
Fissazione dei tessuti di interesse
- Per il fissaggio delle pinne e/o teschi preparare paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS e congelare a-20 ° C per la conservazione. Uso preparata il 4% PFA in PBS o disgelo la quantità necessaria prima dell'uso. In alternativa, il 2% può essere utilizzato PFA in PBS.
Attenzione: PFA è tossica e dovrebbe essere maneggiato con cura sotto cappa aspirante. Indossare indumenti protettivi. - Per il fissaggio delle pinne preparare un piccolo piatto di Petri (ad es. 30 mm) con freddo 4% PFA in PBS e assicurarsi che il fondo del piatto è completamente coperto. Per il fissaggio di teschi, preparare un piccolo vaso di vetro con coperchio o un tubo con freddo 4% PFA in PBS.
Attenzione: Maniglia PFA contenenti soluzioni soltanto sotto la cappa come è tossico. Indossare indumenti protettivi. - Raccogliere il tessuto di interesse.
- Per la raccolta di rigenerazione tessuto pinna o pinne con fratture anestetizzare zebrafish conformemente al punto 2.1 o eutanasia zebrafish conformemente al punto 5.1.5.
- Trasferire il zebrafish anestetizzati al coperchio di una scatola di Petri. Usando un bisturi o lametta, raccogliere la pinna si rigenerano. Assicurati di includere il ceppo del tessuto nella rigenerazione di pinne per facilitare la movimentazione del tessuto raccolto.
- Difficoltà pinne Appartamento in PFA contenente di Petri a 4 ° C durante la notte. Fissazione del piatta evita di curling del tessuto pinna durante la fissazione.
- Per risolvere il piatto, afferrare il tessuto pinna con un forcipe fine al bordo dorsale o ventrale del moncone e immergerlo nella soluzione di fissaggio. Afferrare il bordo opposto del ceppo con un forcipe fine secondo e premere leggermente il tessuto sul fondo del piatto.
- Tenere premuto per 10-20 s prima del rilascio. Il tessuto di pinna non dovrebbe rannicchiarsi piu '. Se lo fa, ripetere.
- Eutanasia zebrafish al fine di raccogliere feriti cranio tessuto. Preparare un diametro di 100 mm di Petri contenente 0,1% MS-222 in acqua pesci. Trasferire uno zebrafish alla volta per la capsula di Petri contenente MS-222 utilizzando una rete da pesca. Quando viene raggiunto il livello 6 dell'anestesia (compressione midollare) attesa almeno 10 minuti per assicurare la morte dell' esemplare12.
- Usando un bisturi taglia la testa più un piccolo tessuto tronco dal resto del corpo. Immergere il tessuto raccolto nella soluzione preparata 4% PFA nel vaso di vetro o tubo di plastica. Difficoltà per 24 h a 4 ° C con dolce dondolio.
- Per conservare i campioni a lungo termine dopo la fissazione, lavarli con PBS (3 x 20 min a RT) e metanolo-delizia in una crescente serie di metanolo (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% di metanolo in PBS per 20 minuti ciascuno).
- Memorizzarli in metanolo al 100% a-20 ° C. In caso contrario, procedere direttamente con la macchiatura dell'osso o altre analisi dopo il lavaggio con PBS.
- Per il fissaggio delle pinne e/o teschi preparare paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS e congelare a-20 ° C per la conservazione. Uso preparata il 4% PFA in PBS o disgelo la quantità necessaria prima dell'uso. In alternativa, il 2% può essere utilizzato PFA in PBS.
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Tecniche di colorazione dell'osso ho (colore rosso di alizarina che macchia)
Nota: Questa colorazione viene eseguita secondo van Eeden et al. 199617 e Walker & Kimmel 200718 con modifiche.- Per eseguire la colorazione di colore rosso di alizarina su pinne adulti o teschi, raccolto e difficoltà del tessuto come descritto nelle sezioni 5.1.
- Se i campioni sono stati conservati in metanolo a-20 ° C, reidratare campioni facendo una serie di metanolo inversa (70%, 50% e 30% in PBS, ogni 1 x 20 min) e lavare due volte 20 min con PBS. Lavare i campioni per 5 min minimo con acqua deionizzata.
- Per fare colore rosso di alizarina macchiatura in teschi, trattare i campioni con tripsina 50 mg/mL in 30% saturi Na2B4O7 a temperatura ambiente durante la notte. Campioni di roccia durante questo tempo. Campioni di risciacquo in 30% Na2B4O7 soluzione satura. Lavare i campioni con acqua deionizzata 2 volte per 5 minuti ciascuno. Questo passaggio non viene eseguito per tessuto pinna.
- Aggiungere la soluzione di colore rosso di alizarina (parte b: 0,5% colore rosso di alizarina S polvere, 10% glicerolo in acqua deionizzata) e i campioni della roccia durante l'incubazione a RT. Check per la macchiatura dopo 1, 2, 4 h o durante la notte.
- Per cancellare i campioni li trattano con una serie decrescente di idrossido: glicerolo 1% potassio (3:1 pernottamento, 1:1 pernottamento, pernottamento di 1:3).
- Conservare i campioni in una soluzione di 1:1 di idrossido di potassio 0,1%: 80% glicerolo e montarli con 80% glicerolo per l'imaging.
Nota: Per combinati Alcian blu/colore rosso di alizarina colorazione trattare campioni con Alcian blu colorazione soluzione (r: parte finale 0,02% Alcian blu, MgCl2, 70% di etanolo) dopo la reidratazione (sezione 5.2.2) per 2 h a RT. Treat pinne con una serie decrescente di etanolo 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, ogni 1 x 15 min) e lavare li per un minimo di 1 h (3 x 20 min) in acqua deionizzata. Procedere con il colore rosso di alizarina macchiatura (vedere paragrafo 5.2).
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Osso di tecniche di colorazione II (calceina colorazione)
Nota: Per rilevare il deposito del calcio nella pinna fratture e lesioni del cranio, pesci vivi sono incubati in calceina contenente soluzione.- Preparare la quantità necessaria di calceina 0,2% in acqua deionizzata (pH 7.5). Assicurarsi che il pH è neutro. Utilizzare 1 M NaOH per aggiustare il pH.
- Incubare fino a 3 zebrafish contemporaneamente in 100 mL di soluzione di calceina per 20 min in un becher di vetro coperto con carta stagnola.
- Trasferire un becher con acqua di pesce zebrafish. Far loro nuotare brevemente prima di trasferirli in un recipiente di nuovo con acqua di pesce. Lasciarli a nuotare in questo nuovo Becher per 20 min a lavare. Scattare foto (vedere paragrafo 5.4).
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Live imaging di zebrafish
- Utilizzare questo approccio per acquisire immagini di rigenerare il tessuto osseo come nella pinna o cranio in tutto l'esperimento senza sacrificare la zebrafish. Anestetizzare zebrafish conformemente al punto 2.1.
- Per acquisire immagini di pinna rigenera, trasferire il zebrafish anestetizzati su un piatto di Petri rivestite con agarosio (cfr. punto 2.2.1 e Figura 1B).
- Per acquisire immagini di rigenerazione delle ossa del cranio, posto in posizione verticale in una spugna (Figura 1) zebrafish o metterlo in un piatto rivestito di agarosio che è stato preparato per tenere il tronco di zebrafish.
- Acquisizione di immagini all'ingrandimento desiderato e ad alta risoluzione utilizzando un programma di installazione di stereomicroscopia.
- Restituire il pesce zebra in un contenitore con fresco o farmaco contenente acqua di pesce.
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Representative Results
Il protocollo presentato qui è stato utilizzato ripetutamente per indurre la formazione rapida dell'osso nel corso della rigenerazione del zebrafish pinna e cranio10,11,16. In combinazione con il metodo di somministrazione di prednisolone, studi sugli effetti di prednisolone durante la rigenerazione dell'osso possono essere perseguiti. Ad esempio, studi sulla formazione dell'osso e mineralizzazione nella rigenera possono essere eseguiti. Prednisolone, come altri glucocorticoidi19,20, conduce ad inibizione generale di rigenerazione di pinna, tra cui la formazione dell'osso, come rilevato da alizarina rosso colorazione sul fisso tessuto pinna caudale (Figura 3A). Allo stesso modo, prednisolone ha un effetto ritardante sulla chiusura di lesioni cranio (calvarial), che può essere illustrata da colore rosso di alizarina (Figura 3B) o in vivo calceina colorazione. Inoltre, prednisolone esercita un profondo effetto antinfiammatorio nel cranio e pinna tessuto, innescando l'apoptosi in monocito/macrofagica. Ridotta del macrofago numeri possono essere rilevati mediante immunoistochimica su tessuto congelato sezioni, ad esempio, utilizzando un anticorpo anti-mcherry in transgenici mpeg1: mCherry zebrafish (Figura 3)10,21 . Allo stesso modo, il numero, la distribuzione, la proliferazione e l'apoptosi di altri tipi cellulari di interesse sia per l'exo - e l'endoscheletro (ad es., vertebre) possono essere analizzati con l'aiuto di immunohistochemistry.
Figura 1 : Procedure eseguite in zebrafish. (A) la resezione della pinna caudale (amputazione) in zebrafish anestetizzati con l'aiuto di un bisturi. La linea rossa tratteggiata indica il livello di amputazione. (B) Fin ray frattura nello zebrafish anestetizzati, effettuato con un ago per iniezione sotto lo stereomicroscopio. Il pesce sta ponendo su una piastra di Petri rivestite su agarosio durante la procedura. Rivestite con agarosio capsule di Petri sono utilizzati anche per acquisire immagini di zebrafish pinne durante la rigenerazione o la riparazione di frattura. (C) trapanazione di calvariae (lesioni cranio) eseguita in zebrafish anaestetized con l'aiuto di un microdrill sotto lo stereomicroscopio. (D) acquisizione della rigenerazione dell'osso del cranio dopo l'infortunio di immagine. Zebrafish anestetizzati è collocato in posizione verticale in una spugna e immagini sono acquisite con l'aiuto di un microscopio stereoscopico. La capsula di Petri è riempita con acqua di pesce contenente 0,02% MS-222. (E) incubazione di zebrafish in prednisolone o DMSO contenente acqua di pesce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Vista microscopica diretta delle lesioni a 0 h post infortunio hpi). (A) pinna caudale Amputated. Barra della scala = 200 µm (B) Fractured pinna ray. La frattura è indicata dalla freccia rossa. Barra della scala = 100 µm. (C) Trepanated del cranio. Il sito di lesione è indicato dalla freccia bianca. Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Risultati rappresentativi di trattamento di prednisolone in zebrafish adulto. (A) alizarina rosso macchiato pinna rigenera alle 14 giorni post amputazione (dpa) e giorni di trattamento (dt). Prednisolone trattato pinna rigenera sono più breve (non mostrato) e un dominio più piccolo di colore rosso di alizarina matrice ossea positivo viene rilevato. Barra della scala = 500 µm. (B) colore rosso di alizarina macchiato teschi a 7 giorni post infortunio (dpi) e dt. Barra della scala = 100 µm. Questa figura è stata modificata con autorizzazione10. (C) donatrici Mostra del teschio illeso e cervello tessuto dei trattati (prednisolone) e non trattato (DMSO) Tg (mpeg1: mCherry) x Tg (osterix: nGFP) pesce transgenico reporter, in cui i macrofagi (cellule immuni innate) sono contrassegnati in rosso 21 e osso formando osteoblasti sono etichettati in verde22. Il numero dei macrofagi scende significativamente in zebrafish prednisolone trattati. Immunohistochemistry è stato effettuato come descritto in Geurtzen et al. 10. i nuclei sono etichettati in blu (DAPI). Barra della scala = 20 µm. BF: campo chiaro, epid: epidermide, bn: osso. Questa figura è stata modificata con autorizzazione10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Zebrafish si sono dimostrati utili nella ricerca scheletrico in molti riguardi. Mutanti selezionati imitano gli aspetti della malattia umana come l'osteogenesi imperfetta o osteoartrite23,24,25,26,27, e le larve, come pure le scale vengono utilizzate per identificare composti anabolizzanti osso piccola molecola schermi7,28,29. Trattamenti di zebrafish con farmaci che vengono applicati nella pratica clinica sono inoltre ideali per studiare i presunti effetti negativi, ad esempio nel tessuto osseo. In questo contesto, la presenza della rapida rigenerazione dell'osso è vantaggiosa per indagare i meccanismi di fondo delle carenze di osso farmaco-indotta. Qui, presentiamo un protocollo in cui il trattamento farmacologico con prednisolone glucocorticoide, un farmaco anti-infiammatorio comunemente usato con effetti negativi nel tessuto osseo, è combinato con regimi di rigenerazione dell'osso adulto. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per indurre immunosoppressiva e osso effetti inibitori nei tessuti rigenerativi di zebrafish e può anche essere adattato per gli studi sull'impatto di prednisolone e di altri farmaci nei tessuti adulti, come la colonna vertebrale. I seguenti dettagli dovrebbero tener conto quando trattamenti farmacologici immunosoppressivi sono eseguiti in zebrafish in fase pinna o rigenerazione del cranio.
Riproducibilità delle analisi di lesioni
Durante la rigenerazione di pinna, velocità di rigenerazione (vale a dire, la ricrescita di tessuto pinna, compreso osso, per unità di tempo) dipende molto dalla quantità di tessuto di pinna che viene resecato13. Al fine di evitare indesiderati variabilità di rigenerazione di pinna, assicurarsi sempre resecare gli importi equivalenti del tessuto pinna in tutti gli esemplari.
L'esecuzione di pinna ossuta ray fratture viene effettuata premendo leggermente un ago per iniezione al centro di un segmento di ray selezionate pinna ossuta. Raggi della pinna ossuta è costituito da 2 contrapposti hemirays, la quantità di pressione utilizzato determina se hemirays solo uno o entrambi sono fratturate. Noi preferiamo applicare pressione bassa alla frattura di un solo hemiray, perché la frattura di entrambe hemirays tende a destabilizzare il raggio della pinna, che di conseguenza può staccare durante il giorno seguente.
Lesioni calvarial del cranio di MICROPERFORAZIONE devono essere eseguite con cautela. Se il danno è fatto al cervello (cioè, il cervelletto) posturale e motorio deficit diventerà evidenti a nuoto irregolare dell' esemplare15. Zebrafish con lesioni cerebellari possono mostrare reazioni avverse al trattamento farmacologico e non deve essere utilizzato per studiare la rigenerazione ossea.
Considerazioni per quanto riguarda i trattamenti farmacologici
Per produrre un consistente effetto immunosoppressivo e anti-rigenerativo in zebrafish adulto ci avvaliamo di una dose del 50 µM prednisolone in acqua pesci. Abbiamo identificato questa dose durante gli esperimenti di dose-risposta iniziale in zebrafish larvale e adulto. Così, esperimenti di dose-risposta dovrebbero essere effettuati per identificare la dose necessaria di altri farmaci immunosoppressivi che potrebbe essere applicato. Per adulti, si consiglia di combinare questi esperimenti iniziali con il regime di rigenerazione di pinna, come rigenerare Lunghezza pinna è una lettura altamente sensibile e facile da rilevare per alterazioni del tessuto.
Il trattamento immunosopressivo predispone i campioni trattati a infezioni microbiche. Pertanto, unico alloggiamento in autoclavato becher contenente acqua pesci sterilizzato nell'autoclave è importante. Anche se queste condizioni sono più ingombranti di svolgere e non sono sterili, essi contribuiscono a ridurre al minimo l'infezione in zebrafish trattata. Abbiamo non pretrattare ('sterilizzare') uova di Artemia. Tuttavia, questo potrebbe essere un'ulteriore misura per prevenire l'infezione in zebrafish, se necessario. Inoltre, sostanze antisettiche come blu di metilene (1%) possono essere aggiunti a pescare acqua prima dell'uso.
Gli esperimenti con il prednisolone, sia a breve e lungo termine, richiedono cambiamenti giornalieri di pesci d'acqua. Abbiamo trattato zebrafish adulto fino a 8 settimane. Trattamento di un gran numero di individui per un lungo periodo può portare a un certo sperimentale «fardello» e deve essere pianificata con cura. È fondamentale avere sempre la quantità necessaria di pesce in autoclave acqua ed articoli di vetro pronto. Anche se questo non è stato testato in zebrafish (a nostra conoscenza), l'impianto di pellet a lento rilascio per farmaci di interesse potrebbe rappresentare una valida alternativa per l'esposizione del farmaco a lungo termine in zebrafish.
Analisi in zebrafish transgenici
Qui, presentiamo 2 metodi a macchiare per mineralizzazione/calcificazione dei tessuti dell'osso di colore rosso di alizarina e calceina macchiatura. Inoltre, vi mostriamo come immagine rigenerante pinna e cranio tessuto in vivo con l'aiuto di un microscopio stereoscopico. La seconda tecnica è molto utile, se zebrafish transgenici segnalazione del numero o dell'attività delle celle selezionate, quali osteoblasti o cellule del sistema immunitario, sono essere imaged. Ad esempio, prima di sacrificare feriti e prednisolone-trattati di zebrafish per eseguire la colorazione di colore rosso di alizarina, pinna rigenera o trepanated teschi in fase di riparazione possono essere fotografati per cercare la presenza, numero e l'attività dell'osso formando osteoblasti in la linea transgenica reporter Tg (osterix: nGFP)22. Allo stesso modo, la chiusura della ferita epidermica, che avviene entro un giorno, possa essere visualizzata in pesci transgenici, che esprimono un fluoroforo in tessuto epidermico. Inoltre, accumulo di cellule immuni al luogo della ferita (o la loro assenza in individui trattati di prednisolone) può essere monitorata facilmente con uno stereomicroscopio dotato di sorgente luminosa necessaria e filtri.
In somma, protocollo presentato qui può essere utilizzato per studiare gli effetti dei farmaci immunosoppressivi e altri farmaci dopo somministrazione sistemica in zebrafish che sono in fase di rigenerazione ossea nella pinna o cranio. Questo sarà utile per delineare la patogenesi di GIO e di indagare i meccanismi di rigenerazione ossea successo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del centro di rigenerativa terapie Dresda ("Zebrafish come modello di svelare i meccanismi di perdita dell'osso indotta da glucocorticoidi") e inoltre da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, progetto 387653785) a FK. Siamo molto grati a Jan Kaslin e Avinash Chekuru per il loro orientamento e assistenza su come eseguire la trapanazione dei calvariae e fratture in raggi della pinna ossuta. Esperimenti sono stati progettati, eseguiti e analizzati da KG e FK. FK ha scritto il manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Katrin Lambert, Nicole Cudak e gli altri membri dei laboratori Knopf e marca per assistenza tecnica e la discussione. Il nostro grazie va anche a Marika Fischer e Jitka Michling per la cura del pesce eccellente e di Henriette Knopf e Josh Currie di correzione il manoscritto per.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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