Voksen zebrafisk skade modeller at studere virkningerne af Prednisolon i regenererende knoglevæv
Summary
Her beskriver vi 3 voksne zebrafisk skade modeller og deres kombinerede anvendelse med immunosuppressiv behandling. Vi vejlede om billeddannelse af regenererende væv og afsløre knoglemineralisering deri.
Abstract
Zebrafisk kan regenerere forskellige organer, herunder vedhæng (finner) efter amputation. Dette indebærer regeneration af knogle, som regrows inden for omkring to uger efter skaden. Desuden zebrafisk er stand til at helbrede ben hurtigt efter trepanation af kraniet, og reparere frakturer, der nemt kan indføres i zebrafisk knoklet fin stråler. Disse skade assays repræsenterer muligt eksperimentelle paradigmer at teste effekten af administreret medicin på hurtigt danner knogle. Her, beskriver vi brugen af disse 3 skade modeller og deres kombinerede anvendelse med systemisk glukokortikoid behandling, som udøver knogle hæmmende og immunosuppressive effekter. Vi leverer en arbejdsproces til at forberede immunosuppressiv behandling i voksen zebrafisk, illustrerer, hvordan du udføre fin amputation, trepanation af calvarial knogler, og fin frakturer, og beskrive, hvordan brugen af glukokortikoider påvirker begge knogler danner osteoblaster og celler af monocyt/makrofag afstamning som del af medfødt immunitet i knoglevæv.
Introduction
Zebrafisk repræsenterer en kraftfuld dyremodel til at studere hvirveldyr udvikling og sygdom. Dette er at de er små dyr, som yngler meget godt og at deres genom er fuldt sekventeret og imødekommenhed over for manipulation1. Andre fordele omfatter muligheden for at udføre fortsatte live imaging på forskellige stadier, herunder i vivo billeddannelse af voksen zebrafisk2, og evnen til at udføre høj overførselshastighed drug skærme i zebrafisk larver3. Desuden zebrafisk besidder en høj regenerative kapacitet i en række organer og væv, herunder knogler, og dermed tjene som et nyttigt system til at studere skelet sygdomme og reparere4,5.
Glukokortikoid-induceret osteoporose (GIO) er en sygdom, der skyldes langvarig behandling med glukokortikoider, for eksempel i forbindelse med autoimmune sygdom behandling såsom astma eller leddegigt. GIO udvikler sig i ca. 30% af glukokortikoid-behandlede patienter og repræsenterer en større sundhed spørgsmål6; Det er derfor vigtigt at undersøge virkningen af immunosuppression på knoglevæv i stor detalje. I de seneste år er blevet udviklet en række forskellige zebrafisk modeller beskæftiger sig med patogenesen af GIO. Glukokortikoid-medieret knogletab er blevet induceret i zebrafisk larver, for eksempel, som førte til identifikation af modsatrettede forbindelser øge knoglemasse i et stof skærmen7. Derudover glukokortikoid induceret knogle hæmmende effekter har været efterlignede i zebrafisk skalerer både in vitro- og i vivo8,9. Disse analyser er meget overbevisende tilgange, især når det kommer til identifikation af roman immunosuppressive og knogle anabolske stoffer. Men de kun delvist tages hensyn til endoskeleton og ikke er blevet udført i forbindelse med regenerativ. Således, de ikke tillader undersøgelse af glukokortikoid-medierede virkninger under hurtige former for voksne, regenerativ knogledannelse.
Vi præsenterer her, en protokol, der gør det muligt for forskere at studere glukokortikoid-medierede virkninger på voksen zebrafisk knogler gennemgår regenerering. Skade modeller omfatter delvis amputation af zebrafisk halefinnen, trepanation af kraniet, samt oprettelsen af fin ray frakturer (figur 1A-1 C), og kombineres med glukokortikoid eksponering via inkubation (figur 1E ). Vi har for nylig brugt en del af denne protokol til at beskrive konsekvenserne af eksponering for Prednisolon, et af almindeligt ordineret kortikosteroid lægemidler, på voksen zebrafisk regenererende fin og kraniet ben10. I zebrafisk fører Prednisolon administration til nedsat osteoblastdannelse spredning, ufuldstændige osteoblastdannelse differentiering og hurtig induktion af apoptose i monocyt/makrofag lineage10. I denne protokol beskrive vi også hvordan frakturer kan indføres i enkelt knoklet fin ray segmenter11, da denne tilgang kan være nyttig, når man studerer glukokortikoid-medierede virkninger på knogle forekommende under fraktur reparation. De metoder, der præsenteres her vil bidrage til yderligere adresse underliggende glukokortikoid virkningsmekanismer i hurtigt regenererende knogle og kan også være ansat i andre indstillinger af systemisk drug administration inden for rammerne af zebrafisk væv revitalisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk har vist sig nyttig i skelet forskning i mange henseender. Valgte mutanter efterligner aspekter af menneskelig sygdom såsom osteogenesis imperfecta eller slidgigt23,24,25,26,27, og larverne samt skalaer der bruges til identificere knogle anabole stoffer i lille molekyle skærme7,28,</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling af den Center i Regenerative behandlinger Dresden (“zebrafisk som en model til at udrede mekanismerne af glukokortikoid induceret knogletab”) og desuden et tilskud af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projekt 387653785) til FK. Vi er meget taknemmelige for Jan Kaslin og Avinash Chekuru deres vejledning og bistand på udfører trepanation calvariae og frakturer i knoklet fin stråler. Eksperimenter blev konstrueret, udført og analyseret af KG og FK. FK skrev manuskriptet. Vi vil også gerne takke Katrin Lambert, Nicole Cudak, og andre medlemmer af de Knopf og mærke labs for teknisk bistand og diskussion. Vores tak går også til Marika Fischer og Jitka Michling for fremragende fisk pleje og Henriette Knopf og Josh Currie for korrekturlæsning håndskriftet.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
Referências
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Biologia do Desenvolvimento. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
