骨組織の再生にプレドニゾロンの効果を研究する大人のゼブラフィッシュ傷害モデル
Summary
ここでは、3 アダルト ゼブラフィッシュ損傷モデルと免疫抑制薬の治療との併用について述べる。再生組織のイメージングに関するガイダンスをそこに骨石灰化を検出することに提供します。
Abstract
ゼブラフィッシュは切断後 (フィン) の付属肢を含む様々 な臓器を再生することができます。受傷後約 2 週間以内に復元する骨の再生が含まれます。さらに、ゼブラフィッシュ、スカルの穿頭後急速に骨を癒すし、ゼブラフィッシュ骨ひれ光線に簡単に導入することができます亀裂を修復することができます。これらの傷害アッセイは、急速に骨の形成に及ぼす投与薬をテストする実現可能な実験パラダイムを表現します。ここでは、これら 3 損傷モデルの使用と骨抑制と免疫抑制効果を発揮する全身性ステロイド治療との併用について述べる。アダルト ゼブラフィッシュにおける免疫抑制療法の準備、フィン切断、頭蓋骨の骨やひれ骨折の穿頭を実行する方法を示す、グルココルチコイドの使用で両方の骨の形成が与える影響について説明する方法でワークフローを提供します。骨芽細胞と骨の自然免疫の一部として単球/マクロファージ系統の細胞。
Introduction
ゼブラフィッシュでは、脊椎動物の発生と疾患研究に強力な動物モデルを表します。これは、彼らは、非常によく繁殖小動物とそのゲノムは完全にシーケンス化された操作1に従うことという事実のためです。その他の利点には、生体内イメージング アダルト ゼブラフィッシュ2とゼブラフィッシュ幼虫3で高スループット薬物画面を実行する機能など、さまざまな段階での継続的なライブ イメージングを実行するためのオプションが含まれます。さらに、ゼブラフィッシュはさまざまな臓器や骨などの組織に高い再生能力を持っているし、骨疾患を勉強して4,5を修復する有用なシステムとして提供します。
ステロイド性骨粗鬆症 (GIO) は、グルココルチコイド、たとえば喘息や慢性関節リウマチの自己免疫疾患治療の過程で長期的治療に起因する疾患です。ジオを表しグルココルチコイド治療を受けた患者の約 30% で成長する、主要な健康上の問題6。したがって、非常に詳細に骨免疫抑制の影響を調査することが重要です。近年さまざまなジオの病態を扱うゼブラフィッシュ モデルが開発されています。グルココルチコイドを介した骨の損失は、ゼブラフィッシュの幼虫、たとえば、薬剤スクリーン7で骨量を増やす中和化合物の同定につながったに誘導されてきました。さらに、ステロイド性骨抑制効果に真似されているゼブラフィッシュ スケールの in vitroとin vivoの8,9。これらの試金は非常に説得力のあるアプローチ、特にに関して新規免疫抑制と骨の同化作用の薬の同定。しかし、彼らは部分的にしか内骨格を考慮し、再生のコンテキストで実行されていません。したがって、彼らは大人、再生骨の急速なモード中のグルココルチコイドを介した効果の調査を許さない。
ここでは、大人のゼブラフィッシュ骨再生を受けているグルココルチコイドを介した効果を研究する研究者を有効にするプロトコルを提案します。傷害モデル ゼブラフィッシュ尾びれ、スカルの穿頭およびひれ光線骨折 (図 1 a-1 C) の作成の部分の切断が含まれ、インキュベーション (図 1Eを介してグルココルチコイド露出と組み合わせて).最近フィンと頭蓋骨の骨10を再生成する大人のゼブラフィッシュの 1 つ一般的に規定する副腎皮質ステロイド薬のプレドニゾロンへの露出の結果を記述するこの議定書の部分を使いました。ゼブラフィッシュ、プレドニゾロン内服は減少した骨芽細胞増殖、不完全な骨芽細胞分化や単球/マクロファージ系統10におけるアポトーシスの急速な誘導につながります。このプロトコルでも述べる骨折が骨のシングルフィンの線のセグメント11に導入できる方法として破壊修復中にグルココルチコイドを介した骨発生効果を勉強して、このアプローチが役に立つかもしれません。紹介した方法は、急速に骨の再生の糖質コルチコイド作用機序を基になる更に対処するのに役立ち、ゼブラフィッシュ組織再生のコンテキストで全身薬物管理の他の設定に用いることもできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュは、多くの点で骨格の研究に役立っています。選択した突然変異体が骨形成不全症、変形性関節症23,24,25,26,27などのひと疾患の側面を模倣し、体重計と同様、幼虫に使用されています。小分子画面7,28,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この調査は、グラントのドレスデン中心部再生療法 (「ゼブラフィッシュ モデルとしてステロイド性骨量減少メカニズムを解明する」)、またドイツ研究振興協会 (Transregio 67, プロジェクトの助成金サポートされました。387653785) FK に。彼らの指導と骨ひれ光線の研究と骨折の trepanation の実行支援を 1 月 Kaslin と Avinash Chekuru に非常に感謝しております。実験では、設計、実行と KG と FK によって解析されました。FK は、原稿を書いていた。また、カトリン ・ ランバート、ニコール Cudak、クノップとブランド ラボ テクニカル サポートや議論のための他のメンバーに感謝したいと思います。感謝は、マリカ Fischer および優秀な魚のケアのための Jitka Michling とアンリエット ・ クノップとジョシュ ・ カリー、原稿の校正のためにまた行きます。
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
Referências
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