Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel
Summary
Hier beschrijven we 3 volwassen zebrafish letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met immunosuppressieve medicamenteuze behandeling. Wij bieden begeleiding over de beeldvorming van het herstel van de weefsels en bot mineralisatie daarin opsporen.
Abstract
Zebravis kunnen verschillende organen, met inbegrip van de aanhangsels (vinnen) regenereren na amputatie. Het gaat hierbij om de regeneratie van bot, die binnen ongeveer twee weken na verwonding verrot. Bovendien, zebravis kunnen genezen been snel na Schedeltrepanatie van de schedel, en repareren van fracturen die gemakkelijk kunnen worden ingevoerd in zebrafish bony fin rays. Deze schade assays vertegenwoordigen haalbaar experimentele paradigma’s voor het testen van het effect van door de overheid gereguleerde drugs over de snelle vorming van bot. Hier beschrijven we het gebruik van deze 3 letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met systemische glucocorticoide behandeling, die bot remmende en immunosuppressieve effecten oefent. Wij bieden een workflow op hoe te bereiden voor immunosuppressieve behandeling in volwassen zebrafish, het uitvoeren van fin amputatie, Schedeltrepanatie van calvarial beenderen en fracturen van de fin, illustreren en beschrijven hoe het gebruik van glucocorticoïden is van invloed op de vorming van zowel bot Botcellen en cellen van de monocyt/macrofaag afkomst als onderdeel van aangeboren immuniteit in botweefsel.
Introduction
Zebravis vertegenwoordigen een krachtige diermodel gewervelde ontwikkeling en ziekte te studeren. Dit is de wijten aan het feit dat ze zijn kleine dieren die zeer goed fokken en dat hun genoom volledig gesequenceerd en vatbaar voor manipulatie-1 is. Andere voordelen zijn de optie voor het uitvoeren van verdere levende imaging in verschillende stadia, met inbegrip van in vivo imaging van volwassen zebrafish2, en de mogelijkheid voor het uitvoeren van hoge-doorvoer drug schermen in zebrafish larven3. Bovendien, zebravis bezitten een hoge regeneratief vermogen in een verscheidenheid van organen en weefsels, waaronder bot, en dus dienen als een nuttig systeem te bestuderen skelet ziekte en repareren van4,5.
Glucocorticoide-geïnduceerde osteoporose (GIO) is een ziekte die het gevolg is van langdurige behandeling met glucocorticoïden, bijvoorbeeld in het kader van behandeling van het auto-immune ziekten zoals reumatoïde artritis of astma. GIO ontwikkelt zich in ongeveer 30% van de glucocorticoide-behandelde patiënten en vertegenwoordigt een belangrijke gezondheid kwestie6; Daarom is het belangrijk om te onderzoeken de impact bij immuunsuppressie op botweefsel in groot detail. In de afgelopen jaren een scala aan zebrafish modellen die zich bezighouden met de pathogenese van GIO zijn ontwikkeld. Glucocorticoide-gemedieerde botverlies heeft zijn geïnduceerd in zebrafish larven, bijvoorbeeld, die hebben geleid tot de identificatie van achteraf verbindingen verhoging van de botmassa in een drug scherm7. Bovendien glucocorticoide-geïnduceerde bot remmende effecten hebben is geïmiteerd zebrafish schalen zowel in vitro als in vivo8,9. Deze testen zijn erg overtuigend benaderingen, met name als het gaat om de identificatie van nieuwe immunosuppressieve en bot anabole drugs. Echter zij slechts gedeeltelijk rekening wordt gehouden met de endoskeleton en niet zijn uitgevoerd in een regeneratieve context. Dus, laat ze niet het onderzoek van glucocorticoide-gemedieerde effecten tijdens snelle modi van volwassen, regeneratieve biomineralisatie.
Hier presenteren we een protocol waarmee onderzoekers glucocorticoide-gemedieerde effecten op volwassen zebrafish botten regeneratie ondergaan te bestuderen. Letsel modellen omvatten gedeeltelijke amputatie van de zebravis caudal fin, Schedeltrepanatie van de schedel, alsmede de oprichting van fin ray fracturen (figuur 1A-1 C), en worden gecombineerd met glucocorticoide blootstelling via incubatie (figuur 1E ). Onlangs hebben we een deel van dit protocol gebruikt om te beschrijven de gevolgen van blootstelling aan de prednisolon, één van de algemeen voorgeschreven corticosteroïd drugs, op volwassen zebrafish fin en schedel bot10regenereren. In zebrafish leidt prednisolon administratie tot verminderde osteoblast proliferatie, onvolledige osteoblast differentiatie en snelle inductie van apoptosis in de monocyt/macrofaag afkomst10. In dit protocol, ook beschrijven we hoe fracturen kunnen worden ingevoerd in één bony fin ray segmenten11, zoals deze aanpak nuttig zijn kan bij de studie van glucocorticoide-gemedieerde effecten op bot die zich kunnen voordoen tijdens de reparatie van de breuk. De methoden die hier gepresenteerd zal bijdragen tot verdere adres onderliggende mechanismen van glucocorticoide actie in snel herstel van bot en kunnen ook worden gebruikt in andere instellingen van systemische drug administration in de context van zebravis weefselregeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebravis hebben bewezen nuttig in skelet onderzoek in vele opzichten. Geselecteerde mutanten nabootsen aspecten van menselijke ziekten zoals osteogenesis imperfecta of artrose23,24,25,26,27, en zowel de larven als de schalen worden gebruikt om bot anabole stoffen in kleine molecuul schermen7,28,</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door een subsidie van het centrum van regeneratieve therapieën Dresden (“zebravis als model te ontrafelen van de mechanismen van glucocorticoide-geïnduceerde botverlies”), en daarnaast door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, project 387653785) naar de FK. We zijn zeer dankbaar aan Jan Kaslin en Avinash Chekuru voor hun advies en assistentie bij het uitvoeren van Schedeltrepanatie van de calvariae en fracturen in benige fin rays. Experimenten werden ontworpen, uitgevoerd en geanalyseerd door KG en FK. FK schreef het manuscript. Wij zouden ook willen bedanken Katrin Lambert, Nicole Cudak, en andere leden van de Knopf en merk labs voor technische bijstand en discussie. Onze dank gaat ook uit aan Marika Fischer en Jitka Michling voor uitstekende vis zorg en Henriette Knopf en Josh Currie voor proeflezen van het manuscript.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
Referências
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Biologia do Desenvolvimento. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
