Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri
Summary
Burada, 3 Yetişkin zebra balığı yaralanma model ve immünsupresif ilaç tedavisi ile kombine kullanımları açıklanmaktadır. Biz doku Yenileyici görüntüleme ve kemik Qafqaz orada tespit rehberlik sağlar.
Abstract
Zebra balığı ekleri (palet) dahil olmak üzere çeşitli organlarda amputasyona sonra yeniden edebiliyoruz. Bu yaralanma sonra yaklaşık iki hafta içinde regrows kemik rejenerasyon içerir. Ayrıca, zebra balığı kemik, hızla sonra kafatasının trepanasyon iyileşmek ve kolayca zebra balığı kemikli fin ışınları tanıttı olabilir kırık onarmak mümkün. Bu yaralanma deneyleri yönetilen uyuşturucu etkisi hızla kemik oluşturan üzerinde test etmek için uygun deneysel paradigmalar temsil eder. Burada, bu 3 yaralanma modellerinin kullanımı ve kemik inhibitör ve immünsupresif etkileri giderek artan sistemik glukokortikoid tedavi ile kombine kullanımları açıklanmaktadır. Biz yetişkin zebra balığı immünsüpresif tedavi için hazırlamak, fin amputasyon, trepanasyon grefti kemik ve fin kırıklar, gerçekleştirmek nasıl göstermek ve her iki kemik oluşturan glukokortikoid kullanımını nasıl etkilediğini açıklamak nasıl bir iş akışı sağlar dokusunu ve hücreler kemik dokusu içinde doğuştan gelen bağışıklık parçası olarak monosit/makrofaj soyundan.
Introduction
Zebra balığı omurgalı geliştirme ve hastalık eğitim için güçlü bir hayvan modeli temsil eder. Gerçeğini onlar are son derece iyi cins küçük hayvanlar ve onların genom tam olarak sıralanmış ve manipülasyon1mükellef nedeni bu. Diğer avantajı vivo içinde görüntüleme yetişkin zebra balığı2ve yüksek işlem hacmi uyuşturucu ekranlar zebra balığı larvalar3‘ te gerçekleştirme olanağı da dahil olmak üzere farklı aşamalarında sürekli canlı görüntüleme gerçekleştirmek için seçeneği içerir. Ayrıca, zebra balığı yüksek yeniden üretim kapasiteli organ ve dokulara kemik dahil olmak üzere çeşitli sahip ve böylece iskelet hastalığı çalışma ve4,5onarmak için yararlı bir sistem olarak hizmet vermektedir.
Osteoporoz (GIO) glukokortikoid indüklenen astım veya romatoid artrit gibi otoimmün hastalığı tedavisi sırasında örneğin glukokortikoid ile uzun vadeli tedavi sonuçları bir hastalıktır. GIO glukokortikoid tedavi edilen hastaların yaklaşık % 30 geliştirir ve önemli bir sağlık sorunu6temsil eder; Bu nedenle, immünosupresyon ayrıntılı olarak kemik dokusu üzerinde etkisini araştırmak önemlidir. Son yıllarda çeşitli GIO patogenezi ile ilgili zebra balığı modeller geliştirilmiştir. Glukokortikoid aracılı kemik kaybı counteractive bileşikler kemik kütlesi bir uyuşturucu ekran7artan tanımlaması için yol açan zebra balığı larva, örneğin, içinde indüklenen. Ayrıca, glukokortikoid kaynaklı kemik inhibitör etkileri içinde taklit zebra balığı ölçekler vitro ve in vivo8,9. Bu deneyleri çok ikna edici yaklaşımlar, özellikle de gelir roman immünsüpresif ve kemik anabolik uyuşturucu tanımlaması. Ancak, onlar sadece kısmen iskelet dikkate almalı ve rejeneratif bir bağlamda gerçekleştirilen değil. Böylece, bunlar glukokortikoid aracılı etkileri soruşturma hızlı modları yetişkin, rejeneratif kemik oluşumu sırasında izin vermez.
Burada, yenilenme geçiren yetişkin zebra balığı kemik üzerindeki etkileri glukokortikoid aracılı çalışmaya araştırmacılar sağlayan bir iletişim kuralı mevcut. Yaralanma modelleri kısmi amputasyon zebra balığı kaudal fin, kafatası trepanasyon yanı sıra yüzgeç ışın kırıkları (Şekil 1A-1 C) oluşturulması ve glukokortikoid kuluçka maruz kalma yoluyla ile (Şekil 1E birleştirilir ). Biz son zamanlarda yetişkin zebra balığı yüzgeci ve kafatası kemik10Yenileyici prednizolon, bir sık reçete kortikosteroid ilaçların maruz sonuçlarını açıklamak için bu iletişim kuralı bir kısmını kullandık. Zebra balığı, azalan osteoblast yayılması, eksik osteoblast farklılaşma ve Apoptozis monosit/makrofaj lineage10hızlı indüksiyon prednizolon yönetim yol açar. Glukokortikoid aracılı etkileri kemik meydana gelen kırık onarım sırasında okurken bu yaklaşım yararlı olabilir gibi bu protokol için biz de nasıl kırıklar tek kemikli yüzgeç ışın kesimleri11tanıttı olabilir açıklar. Burada sunulan yöntemleri mekanizmaları hızla kemik Yenileyici glukokortikoid Action altında yatan daha fazla adres için yardımcı olacak ve ayrıca zebra balığı doku rejenerasyonu sistemik ilaç idaresi bağlamında diğer ayarlarında istihdam edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı iskelet araştırma birçok bakımdan yararlı kanıtlamış. Seçili mutantlar osteogenesis imperfekta veya osteoartrit23,24,25,26,27gibi insan hastalık yönlerini taklit ve larva yanı sıra ölçekler için kullanılmaktadır kemik anabolik bileşikler küçük molekül ekranlar7,28…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada bir hibe merkezi rejeneratif terapiler Dresden (“glukokortikoid kaynaklı kemik kaybı mekanizmaları çözülmeye zebra balığı bir model olarak”) ve ayrıca Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, proje verilmesi tarafından desteklenmiştir 387653785) FK için. Jan Kaslin ve Avinash Chekuru onların rehberlik ve kemikli fin ışınları calvariae ve kırıklar trepanasyon yapılması hakkında yardım için minnettarız. Deneyler tasarlanmış, gerçekleştirilen ve KG ve FK tarafından analiz etti. FK el yazması yazdı. Biz de Katrin Lambert, Nicole Cudak ve diğer üyeleri Knopf ve marka labs teknik yardım ve tartışma için teşekkür etmek istiyorum. Bizim teşekkür da Marika Fischer ve Jitka Michling mükemmel balık bakımı ve Henriette Knopf ve Josh için el yazması yazım denetleme Currie gider.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
Referências
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Biologia do Desenvolvimento. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
