Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo
Summary
Aquí, Describimos 3 modelos de lesión del pez cebra adulto y su uso combinado con tratamiento inmunosupresor. Proporcionamos orientación en proyección de imagen de regenerar los tejidos y en la detección de la mineralización ósea en esto.
Abstract
Pez cebra son capaces de regenerar órganos diversos, incluyendo apéndices (aletas) después de la amputación. Se trata de la regeneración del hueso, que regrows en aproximadamente dos semanas después de lesión. Además, el pez cebra son capaces de curar hueso rápidamente después de la trepanación del cráneo y reparar las fracturas que pueden introducirse fácilmente en los rayos de aletas huesudas de pez cebra. Estos ensayos de lesiones representan posibles paradigmas experimentales para probar el efecto de drogas administradas en la rápida formación de hueso. Aquí, describimos el uso de estos modelos de 3 lesiones y su uso combinado con tratamiento con glucocorticoides sistémicos, que ejerce efectos inhibitorios e inmunosupresores hueso. Proporcionar un flujo de trabajo sobre cómo prepararse para el tratamiento inmunosupresivo en pez cebra adulto, ilustrar cómo realizar amputación de aleta, trepanación de los huesos calvarial y fracturas de la aleta y describen cómo el uso de glucocorticoides afecta ambos huesos formando osteoblastos y células del linaje monocito/macrófago como parte de la inmunidad innata en el tejido óseo.
Introduction
Pez cebra representan un poderoso modelo animal para estudiar enfermedades y del desarrollo de vertebrados. Esto es debido a que son pequeños animales que se reproducen muy bien y que su genoma completamente secuenciado y susceptibles de manipulación1. Otras ventajas incluyen la opción de realizar imágenes en continuo en diferentes etapas, incluyendo en vivo la proyección de imagen de pez cebra adulto2y la capacidad para realizar pantallas de drogas de alto rendimiento en larvas de pez cebra3. Además, pez cebra poseen una alta capacidad regenerativa en una variedad de órganos y tejidos incluyendo hueso y así servir como un sistema útil para estudiar enfermedad esquelética y reparar4,5.
Osteoporosis inducida por glucocorticoides (GIO) es una enfermedad que resulta del tratamiento a largo plazo con glucocorticoides, por ejemplo en el curso de tratamiento de enfermedades autoinmunes como asma o artritis reumatoide. GIO se desarrolla en aproximadamente el 30% de los pacientes tratados con glucocorticoides y representa un importante salud número6; por lo tanto, es importante investigar el impacto de la inmunosupresión en tejido óseo en gran detalle. En los últimos años se han desarrollado una variedad de modelos de pez cebra con la patogenesia de GIO. Pérdida de masa ósea mediada por los glucocorticoides ha sido inducida en pez cebra larvas, por ejemplo, que condujo a la identificación de los compuestos, aumentando la masa ósea en una droga pantalla7. Además, han sido mímico efectos inhibitorios ósea inducida por glucocorticoides en pez cebra escalas tanto in vitro e in vivode8,9. Estos ensayos son muy convincentes enfoques, especialmente cuando se trata de la identificación de nuevos fármacos inmunosupresores y hueso anabólicos. Sin embargo, sólo en parte tener en cuenta el endoesqueleto y no se ha realizado en un contexto regenerativo. Por lo tanto, no permiten la investigación de efectos mediada por glucocorticoides durante rápidos modos de formación de adultos, regenerador óseo.
Aquí, presentamos un protocolo permitiendo a los investigadores estudiar mediada por glucocorticoides efectos sobre los huesos de pez cebra adulta experimentando regeneración. Modelos de lesión incluyen la amputación parcial de la aleta caudal de pez cebra, trepanación del cráneo, así como la creación de las fracturas fin ray (figura 1A-1 C) y se combinan con glucocorticoides exposición por medio de incubación (Figura 1E ). Recientemente hemos utilizado una parte de este protocolo para describir las consecuencias de la exposición a la prednisolona, uno de los fármacos corticosteroides comúnmente prescritos, en pez cebra adulto regenerar aletas y cráneo hueso10. En el pez cebra, administración de prednisolona conduce a disminución de osteoblastos proliferación, la diferenciación osteoblástica incompleta y rápida inducción de la apoptosis en el linaje monocito/macrófago del10. En este protocolo, también describimos cómo las fracturas pueden ser introducidas en sola aleta huesuda ray segmentos11, como este enfoque puede ser útil al estudiar mediada por glucocorticoides efectos sobre hueso que se produce durante la reparación de la fractura. Los métodos presentados aquí ayudarán a otra dirección subyacen mecanismos de acción glucocorticoide en rápidamente la regeneración del hueso y también pueden ser empleados en otros entornos de administración sistémica en el contexto de la regeneración de tejido de pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pez cebra han demostrado utilidad en la investigación esquelética en muchos aspectos. Las mutantes imitan aspectos de la enfermedad humana como la osteogénesis imperfecta o artrosis23,24,25,26,27y larvas así como escalas se utilizan para identificar compuestos anabólicos óseos en moléculas pequeñas pantallas7,<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por una beca de la centro de regenerativa terapias Dresden (“pez cebra como modelo para desentrañar los mecanismos de pérdida de masa ósea inducida por glucocorticoides”) y además por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (67 Transregio, proyecto 387653785) de FK. Estamos muy agradecidos a Jan Kaslin y Avinash Chekuru por su orientación y ayuda en realizar trepanaciones de los calvariae y fracturas en los radios de la aleta huesuda. Experimentos fueron diseñados, realizados y analizados por KG y FK. FK escribió el manuscrito. También nos gustaría agradecer a Katrin Lambert, Nicole Cudak y otros miembros de los laboratorios de Knopf y marca para asistencia técnica y de discusión. Nuestro agradecimiento también va a Marika Fischer y Jitka Michling para el cuidado de excelentes pescados y a Henriette Knopf y Josh Currie para corregir el manuscrito.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
Referências
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Biologia do Desenvolvimento. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
