Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van kationische nanoliposomes, die is gebaseerd op de methode van de droge-film en kan worden gebruikt voor de veilige en efficiënte levering van in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA.
De ontwikkeling van boodschapper-RNA (mRNA)-op basis van therapieën voor de behandeling van verschillende ziekten meer en meer belangrijk vanwege de positieve wordt eigenschappen van in vitro getranscribeerd (IVT) mRNA. Met de hulp van IVT mRNA, kan de DOVO synthese van een gewenste eiwit worden opgewekt zonder het wijzigen van de fysiologische status van de doelcel. Bovendien, eiwit biosynthese kan precies worden gecontroleerd als gevolg van de voorbijgaande effect van IVT mRNA.
Voor de efficiënte transfectie van cellen, kunnen nanoliposomes (NLps) vormen een veilige en efficiënte leveringsvoertuig voor therapeutische mRNA. Deze studie beschrijft een protocol voor het genereren van veilige en efficiënte kationische NLps bestaande uit DC-cholesterol en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) als een levering vector voor IVT mRNA. NLps hebben een gedefinieerde grootte, een homogene verdeling, en een hoge kleurverandering capaciteit, en kan worden geproduceerd met behulp van de methode droge-film. Bovendien presenteren we verschillende testsystemen voor het analyseren van hun kleurverandering en transfectie efficacies met behulp van synthetische verbeterd groen fluorescent proteïne (eGFP) mRNA, alsmede hun effect op de levensvatbaarheid van de cellen. Over het algemeen voorziet gepresenteerd het protocol een effectieve en veilige benadering mRNA kleurverandering, die kan bevorderen en verbeteren van het beheer van therapeutische mRNA.
Het gebruik van gemodificeerde mRNA voor therapeutische toepassingen blijkt groot potentieel in de laatste paar jaar. In monogenetic, cardiovasculaire en inflammatoire ziekten, evenals bij de ontwikkeling van vaccins, is mRNA een veelbelovende therapeutische agent1.
Eiwit substitutietherapie met mRNA biedt diverse voordelen ten opzichte van de klassieke gentherapie, die is gebaseerd op de transfectie van het DNA in de doel cellen2. De functie van mRNA initieert rechtstreeks in het cytosol. Hoewel het plasmide DNA (pDNA), een constructie van het double-stranded, circulaire kan DNA met een promotor-regio en een sequentie van genen codering van de therapeutische eiwitten3, ook daden in cytosol, het alleen worden opgenomen in cellen die zijn gaan door mitose op het moment van transfectie. Dit vermindert het aantal transfected cellen in het weefsel1,4. De transfectie van weefsels met zwakke mitose activiteit, zoals hartcellen, is met name moeilijk5. In tegenstelling tot pDNA optreden de transfectie en vertaling van mRNA in de cellen van de mitotische en niet-mitotische in het weefsel1,6. De virale integratie van DNA in het genoom van de gastheer kan komen met mutagene effecten of immuunreacties7,8, maar na de transfectie van cellen met een eiwit-encoding mRNA, de DOVO -synthese van de gewenste eiwit begint autonoom9,10. Bovendien kan de eiwitsynthese juist naar de behoefte van de patiënt door middel van individuele doses, zonder mengend in het genoom en het gevaar van mutagene effecten11worden aangepast. Het potentieel immuun-activeren van synthetisch gegenereerde mRNA kan drastisch worden verlaagd met behulp van pseudo-uridine en 5′-methylcytidine in plaats van uridine en cytosinetrifosfaat12. Pseudo-uridine gemodificeerde mRNA is ook aangetoond dat een verhoogde biologische stabiliteit en een aanzienlijk hogere translationeel capaciteit13.
Om te kunnen profiteren van de veelbelovende eigenschappen van mRNA gebaseerde therapie in klinische toepassingen, is het essentieel om een geschikt voertuig voor het vervoer van mRNA in de cel. Dit voertuig moet dragen niet-toxische eigenschappen in vitro pt in vivo, de mRNA tegen nuclease-afbraak te beschermen, en bieden voldoende cellulaire opname voor een langdurige beschikbaarheid en vertaling van de mRNA14.
Onder allerlei mogelijke vervoerder voor in vivo drug levering, zoals koolstof nanotubes en quantumdots liposomen, de laatste zijn geweest de meest15,16studeerde. Liposomen zijn blaasjes bestaande uit een lipide dubbelgelaagde10. Ze zijn amfifiele met een hydrofobe en een hydrofiele sectie, en door de zelfstandige regeling van deze moleculen, is een bolvormige dubbellaagse gevormde17. Binnen de liposomen, kunnen therapeutische agenten of drugs worden ingekapseld en, dus, beschermd tegen enzymatische afbraak18. Liposomen met N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propaan] (DOTAP)20pt21van het dioctadecylamidoglycylspermine (honden), of DC-cholesterol22, zijn goed gekenmerkt en vaak gebruikt voor cellulaire transfectie met DNA of RNA.
Kationogene liposomen bestaat uit een positief geladen lipide en een ongeladen fosfolipide23. Transfectie via kationische liposomen is één van de meest voorkomende methoden voor het vervoer van nucleic zuren in cellen24,25. De deeltjes van kationische lipide vormen complexen met de negatief-geladen fosfaat groepen in de ruggengraat van nucleïnezuur moleculen26. Deze zogenaamde lipoplexes hechten aan het oppervlak van de celmembraan en voer de cel via endocytosis of endocytose-achtige-mechanismen27.
In 1989, Malone, et al.. succesvol beschreven kationische lipide-gemedieerde mRNA transfectie28. Echter, met behulp van een mengsel van DOTMA en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), de groep vond dat DOTMA geopenbaard cytotoxische effecten28. Zohra et al. toonde bovendien aan dat DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumformiaat-propaan chloride) kan worden gebruikt als een reagens van mRNA transfectie29. Echter, voor de efficiënte transfectie van cellen, DOTAP moeten worden gebruikt in combinatie met andere reagentia, zoals fibronectine29 of DOPE30. Tot nu toe, was DOTMA de eerste kationische lipide in de markt voor de levering van gene31. Andere lipiden als therapeutische dragers worden gebruikt of worden getest in verschillende stadia van klinische proeven, (bijvoorbeeld EndoTAG-I, met DOTAP als de drager van een lipide), wordt momenteel onderzocht in een klinische trial fase-II32.
Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van NLps met DC-cholesterol en DOPE. Deze methode is gemakkelijk uit te voeren en maakt de generatie van NLps van verschillende grootte. Het algemene doel van NLp generatie met de droge-film-methode is het creëren van liposomen voor mRNA kleurverandering, waardoor op efficiënte en biocompatibel cel transfectie in vitro14,33.
Het gepresenteerde protocol beschrijft de generatie van NLps met hoge inkapseling werkzaamheid voor synthetisch gemodificeerde mRNA, evenals de betrouwbare transfectie van cellen in vitro. Bovendien is de NLps garanderen de vrijlating van mRNA, die op zijn beurt, is vertaald in een functioneel proteïne in de cellen. Bovendien, de transfections met behulp van NLps kan worden uitgevoerd in normale cel medium, wat resulteert in hoge cel viabilities tijdens transfectie en duren tot drie dagen na de transfectie.
…The authors have nothing to disclose.
Geen
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |