여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.
메신저 RNA (mRNA)의 개발-기반 치료제 다양 한 질병의 치료에 긍정적인 때문에 점점 더 중요 한 된다 생체 외에서 의 속성 (IVT) mRNA를 베 꼈 다. IVT mRNA의 도움으로, 원하는 단백질의 de novo 종합 목표 셀의 생리 적 상태를 변경 하지 않고 유도 될 수 있다. 또한, 단백질 생 합성 IVT mRNA의 일시적 효과의 한 정확 하 게 제어할 수 있습니다.
셀의 효율적인 transfection nanoliposomes (NLps) 치료 mRNA에 대 한 안전 하 고 효율적인 배달 차량을 나타낼 수 있습니다. 이 연구는 IVT mRNA에 대 한 배달 벡터로 안전 하 고 효율적인 양이온 NLps DC 콜레스테롤 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 구성 (마약)을 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다. NLps를 정의 하는 데 크기, 균일 분포, 그리고 높은 complexation 용량, 그리고 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 생성 될 수 있다. 또한, 우리가 다른 테스트 시스템의 complexation 분석을 제시 하 고 합성을 사용 하 여 transfection 신진대사 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) mRNA, 뿐만 아니라 세포 생존 능력에 미치는 영향. 전반적으로, 제시 프로토콜 mRNA complexation 하 고 치료 mRNA의 관리를 향상 시킬 수 있습니다에 대 한 효과적이 고 안전한 접근을 제공 합니다.
치료 응용 프로그램에 대 한 수정 된 mRNA의 사용은 지난 몇 년 동안에에서 큰 잠재력을 보이고 있다. 심장 혈관, 염증, 그리고 monogenetic 질병에서 뿐만 아니라 백신 개발에, mRNA는 유망한 치료 에이전트1.
MRNA와 단백질 대체 요법 대상 셀2에 DNA transfection에 따라 고아 한 유전자 치료를 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. MRNA 함수는 cytosol에서 직접 시작합니다. 비록 플라스 미드 DNA (pDNA), 더블-좌초의 구조, 원형 발기인 지역과 치료 단백질3을 또한 행위 cytosol, 인코딩 유전자 시퀀스를 포함 하는 DNA 그것만 통합 될 수 있다 유사 분열을 겪고 있는 셀에 transfection의 때. 이 조직1,4transfected 세포의 수를 줄입니다. 특히, 심장 세포, 등 약한 유사 분열 활동 조직의 transfection 어려운5입니다. PDNA, 달리 transfection 그리고 mRNA의 번역 조직1,6에 mitotic 그리고 비 mitotic 세포에서 발생합니다. 변이 원 성 영향 또는 면역 반응7,8, 하지만 원하는 단백질의 de novo 종합 단백질 인코딩 mRNA와 세포의 transfection 후 호스트 게놈 DNA의 바이러스 성 통합 올 수 있습니다. 9,10자율적으로 시작합니다. 또한, 단백질 합성 게놈을 방해 하 고 변이 원 성 영향11위험 없이 개별 복용량을 통해 환자의 필요를 정확 하 게 조정할 수 있습니다. 합성으로 생성 된 mRNA의 면역 활성화 잠재력 의사 uridine 및 5′-methylcytidine uridine 및 cytidine12대신 사용 하 여 극적으로 낮아질 수 있습니다. 의사 uridine 수정된 mRNA 또한 증가 생물학적 안정성과 상당히 높은 변환 용량13을 보였다.
mRNA 기반 치료 임상 응용에 유망한 속성에서 이익을 얻을 수 있을, 하 셀으로 mRNA의 전송에 대 한 적합 한 차량을 만들 필수적 이다. 이 차량은 한다 곰 비 독성 속성에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, 보호 nuclease 저하에 대 한 mRNA 하 고 장기간된 가용성 및14mRNA 번역에 대 한 충분 한 세포질 통풍 관을 제공.
Vivo에서 약물 전달, 탄소 나노튜브, 양자 점, 등 리에 대 한 모든 가능한 캐리어 종류 중에서 후자 되었습니다 공부 가장15,16. 리는 지질 bilayer10구성 된 소포. 그들은 amphiphilic는 소수 성 및 친수성 섹션, 그리고 이러한 분자의 자기 배열을 통해 구형 더블 레이어는 형성된17. 리, 내부 치료 대리인 또는 마약 수 캡슐화 되며, 따라서, 효소 저하18에서 보호. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium 염화 (DOTMA)19를 포함 하는 리 [1, 2-비스 (oleoyloxy)-3-프로 판 (trimethylammonio)] (DOTAP)20및 dioctadecylamidoglycylspermine (개)21또는 DC-콜레스테롤22, 잘 특징 및 DNA 또는 RNA 세포 transfection에 자주 사용.
양이온 리 충전 된 지질과 충전된 인지질23구성. 양이온 리 통해 transfection 셀24,25으로 핵 산의 수송을 위한 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 양이온 지질 입자 핵 산 분자26의 등뼈에 마이너스로 충전 된 인산 염 그룹으로 복합물을 형성 한다. 이러한 소위 lipoplexes 세포 막의 표면에 부착 하 고 endocytosis 또는 endocytosis 같은 메커니즘27셀을 입력 합니다.
1989 년에 말론 외. 성공적으로 양이온 지질 중재 mRNA transfection28설명. 그러나, 그룹 DOTMA 각 세포 독성 효과28성 발견 혼합물의 DOTMA 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (마약)를 사용 하 여. 또한, Zohra 외 보여주었다 DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-프로 판 염화) mRNA transfection 시 약29으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포의 효율적인 transfection에 대 한 DOTAP는 다른 시 약, fibronectin29 등 마약30와 함께에서 사용 해야 합니다. 지금까지, DOTMA 유전자 배달31사용 시장에 첫 번째 양이온 지질 이었다. 다른 지질 치료 운반대로 사용 또는 임상 시험의 다른 단계에서 테스트 되 고 있습니다 (예를 들어, EndoTAG-나 지질 운반대로 DOTAP를 포함)는 현재 단계 II 임상 시험32에서 조사 되 고.
이 작품에서는 NLps DC 콜레스테롤 및 마약의 세대에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 실행 하기 쉬운 이며 다양 한 크기의 NLps 생성 수 있습니다. 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 NLp의 일반적인 목표는 mRNA complexation, 따라서 효율적이 고 생체 세포 transfection 생체 외에서14,33를 허용에 대 한 리를 만드는 것입니다.
제시 프로토콜 종합적 수정된 mRNA에 대 한 높은 캡슐화 효능 NLps의 세대 뿐만 아니라 세포에 생체 외에서의 신뢰할 수 있는 transfection에 설명합니다. 또한,는 NLps 차례로 셀 내부 기능적인 단백질으로 번역은 mRNA의 출시를 보장 합니다. 또한, NLps를 사용 하 여 transfections 일반 세포 매체에서 수행할 수 있습니다, 그리고 높은 결과 viabilities 동안 transfection, 세포 transfection 후 최대 3 일.
<p class="…The authors have nothing to disclose.
없음
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
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