JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Generation av katjoniska Nanoliposomes för effektiv leverans av In Vitro transkriberas budbärar-RNA

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för generering av katjoniska nanoliposomes, som bygger på metoden torr-film och kan användas för säker och effektiv leverans av in vitro- transkriberas budbärar-RNA.

Abstract

Utvecklingen av budbärar-RNA (mRNA)-baserade läkemedel för behandling av olika sjukdomar blir viktigare på grund av positiva egenskaperna för in vitro- transkriberas (IVT) mRNA. Med hjälp av IVT mRNA, kan de novo syntesen av en önskad protein induceras utan att ändra det fysiologiska tillståndet av målcellen. Dessutom kan proteinbiosynthesisen kontrolleras just på grund av den övergående effekten IVT mRNA.

För den effektiva transfection celler, kan nanoliposomes (NLps) representera en säker och effektiv leveransfordon för terapeutiska mRNA. Denna studie beskriver ett protokoll för att generera säkra och effektiva katjoniska NLps bestående av DC-kolesterol och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (knark) som en leverans vektor för IVT mRNA. NLps med en definierad storlek, en homogen fördelning och en hög komplexering kapacitet, och kan produceras med hjälp av metoden torr-film. Dessutom presenterar vi olika testsystem för att analysera deras komplexering och transfection efficacies använder syntetiska enhanced grönt fluorescerande protein (andra) mRNA, liksom deras effekt på cellernas viabilitet. Sammantaget ger presenterade protokollet en effektiv och säker metod för mRNA komplexering, vilket kan främja och förbättra förvaltningen av terapeutiska mRNA.

Introduction

Användning av modifierade mRNA för terapeutiska tillämpningar har visat stor potential i de senaste två åren. I hjärt-, inflammatoriska och monogenetic sjukdomar, liksom utveckla vacciner, är mRNA en lovande terapeutisk agent1.

Protein ersättningsbehandling med mRNA erbjuder flera fördelar jämfört med den klassiska genterapi, som är baserat på DNA transfection in i målet cellerna2. Funktionen mRNA initierar direkt i cytosolen. Även om plasmiden DNA (pDNA), en konstruktion av dubbelsträngat, cirkulär kan DNA som innehåller en promotor regionen och en gensekvens som kodning av terapeutiska protein3, även handlingar i cytosolen, det bara införlivas i celler som genomgår Mitos vid tidpunkten för transfection. Detta minskar antalet transfekterade celler vävnad1,4. Specifikt är transfection av vävnader med svag Mitos aktivitet, till exempel hjärtats celler, svår5. I motsats till pDNA förekommer den transfection och översättning av mRNA i mitotiska och icke-mitotiska celler i vävnad1,6. Viral integrering av DNA i värd genomet kan komma med mutagena effekter eller immuna reaktioner7,8, men efter transfection av celler med en protein-encoding mRNA, de novo syntesen av proteinet önskad börjar självständigt9,10. Proteinsyntesen kan dessutom justeras exakt till patientens behov genom individuella doser, utan stör genomet och riskera mutagena effekter11. Immun-aktiverande potential av syntetiskt genererade mRNA kan sänkas dramatiskt med hjälp av pseudo uridin och 5′-methylcytidine istället för uridin och cytidin12. Pseudo uridin modifierade mRNA har också visat sig ha en ökad biologisk stabilitet och en betydligt högre translationell kapacitet13.

För att kunna dra nytta av de lovande egenskaperna av mRNA-baserad terapi i kliniska tillämpningar, är det viktigt att skapa ett lämpligt fordon för transport av mRNA in i cellen. Detta fordon bör bära icke-toxiska egenskaper in vitro- och in-vivo, skydda mRNA mot nuclease-nedbrytning och ge tillräcklig cellernas upptag för en långvarig tillgänglighet och översättning av mRNA14.

Bland alla möjliga bärare typer för i vivo drogen leverans, såsom kolnanorör, kvantprickar och liposomer, den senare har studerat de15,16. Liposomer är blåsor bestående av en lipid lipidens10. De är amfifila med en hydrofob och en hydrofil avsnitt, och genom egen arrangemanget av dessa molekyler, är en sfärisk dubbla lager bildas17. Inuti liposomer, kan terapeutiska medel eller läkemedel vara inkapslade och således skyddas från enzymatisk nedbrytning18. Liposomer innehållande N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium klorid (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20, och dioctadecylamidoglycylspermine (hundar)21, eller DC-kolesterol22, är väl karakteriserade och ofta används för cellulära transfection med DNA eller RNA.

Katjoniska liposomer består av en positivt laddad lipid och en oladdad fosfolipid23. Transfection via katjoniska liposomer är en av de vanligaste metoderna för transport av nukleinsyror in celler24,25. Katjoniska lipid partiklarna bildar komplex med de negativt laddade fosfatgrupper i ryggraden i nukleinsyra molekyler26. Dessa så kallade lipoplexes fäster på ytan av cellmembranet och in i cellen via endocytos eller endocytos-liknande-mekanismer27.

I 1989, Malone et al. framgångsrikt beskrivs katjoniska lipid-medierad mRNA transfection28. Dock fann använder en blandning av DOTMA och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (knark), gruppen att DOTMA manifesterade cytotoxiska effekter28. Zohra et al. visade dessutom att DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimetylammoniumformiat-propan klorid) kan användas som en mRNA transfection reagens29. Dock för den effektiva transfection celler, bör DOTAP användas i kombination med andra reagens, såsom Fibronektin29 eller knark30. Hittills, var DOTMA den första katjoniska lipid på marknaden används för gen leverans31. Andra lipider används som terapeutiska bärare eller har testats i olika stadier av kliniska prövningar (t.ex. EndoTAG-I, innehållande DOTAP som lipid bärare), undersöks för närvarande i en fas-II klinisk prövning32.

Detta arbete beskriver ett protokoll för generering av NLps innehållande DC-kolesterol och knark. Denna metod är enkel att utföra och tillåter generering av NLps olika storlekar. Det generella målet för NLp generation med torr-film-metoden är att skapa liposomer för mRNA komplexering, vilket möjliggör effektiv och biokompatibla cell transfection in vitro-14,33.

Protocol

1. generering av katjoniska Nanoliposomes (figur 1) Lös lipider DC-kolesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] kolesterol hydroklorid) och knark (dioleoyl fosfatidyletanolamin), levereras som ett pulver, i kloroform att uppnå en slutlig koncentration av 25 mg/mL.Obs: Förvara de upplösta lipider vid-20 ° C. Arbeta med 25 mg/mL stamlösning av både lipider. Mix 40 µL av den upplösta DC-kolesterolhalt och 80 µL av den upplöst knark i en glas-k…

Representative Results

Använder protokollet som beskrivs, var NLps bestående av lipider DC-kolesterol och knark förberedda med metoden torr-film (figur 1). Under förberedelsen visar nanoliposome lösningen olika skeden i grumlighet (figur 2). Inkapsling effekten av NLps kan sedan analyseras efter inkapsling av 1 µg andra-encoding mRNA genom att analysera gratis mängden mRNA, som inte va…

Discussion

Presenterade protokollet beskriver generationen NLps med hög inkapsling effekt för syntetiskt modifierade mRNA, liksom den pålitliga transfection av celler in vitro. Dessutom garanterar NLps frisläppandet av mRNA, som i sin tur översätts till ett funktionellt protein inne i cellerna. Dessutom de transfections som använder NLps kan utföras i regelbunden cell medium, vilket resulterar i hög cell förmåga under transfection, och pågå upp till tre dagar efter transfection.

Fö…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ingen

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics–developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don’t shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -. K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -. P., Krajewski, S., Kormann, M. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. , 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. “In vivo” distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

Tags

Cationic NanoliposomesMRNA DeliveryTransfectionNanoparticleLipid FilmExtrusionNanolipoplexA549 Cells
check_url/pt/58444?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image