Här beskriver vi ett protokoll för generering av katjoniska nanoliposomes, som bygger på metoden torr-film och kan användas för säker och effektiv leverans av in vitro- transkriberas budbärar-RNA.
Utvecklingen av budbärar-RNA (mRNA)-baserade läkemedel för behandling av olika sjukdomar blir viktigare på grund av positiva egenskaperna för in vitro- transkriberas (IVT) mRNA. Med hjälp av IVT mRNA, kan de novo syntesen av en önskad protein induceras utan att ändra det fysiologiska tillståndet av målcellen. Dessutom kan proteinbiosynthesisen kontrolleras just på grund av den övergående effekten IVT mRNA.
För den effektiva transfection celler, kan nanoliposomes (NLps) representera en säker och effektiv leveransfordon för terapeutiska mRNA. Denna studie beskriver ett protokoll för att generera säkra och effektiva katjoniska NLps bestående av DC-kolesterol och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (knark) som en leverans vektor för IVT mRNA. NLps med en definierad storlek, en homogen fördelning och en hög komplexering kapacitet, och kan produceras med hjälp av metoden torr-film. Dessutom presenterar vi olika testsystem för att analysera deras komplexering och transfection efficacies använder syntetiska enhanced grönt fluorescerande protein (andra) mRNA, liksom deras effekt på cellernas viabilitet. Sammantaget ger presenterade protokollet en effektiv och säker metod för mRNA komplexering, vilket kan främja och förbättra förvaltningen av terapeutiska mRNA.
Användning av modifierade mRNA för terapeutiska tillämpningar har visat stor potential i de senaste två åren. I hjärt-, inflammatoriska och monogenetic sjukdomar, liksom utveckla vacciner, är mRNA en lovande terapeutisk agent1.
Protein ersättningsbehandling med mRNA erbjuder flera fördelar jämfört med den klassiska genterapi, som är baserat på DNA transfection in i målet cellerna2. Funktionen mRNA initierar direkt i cytosolen. Även om plasmiden DNA (pDNA), en konstruktion av dubbelsträngat, cirkulär kan DNA som innehåller en promotor regionen och en gensekvens som kodning av terapeutiska protein3, även handlingar i cytosolen, det bara införlivas i celler som genomgår Mitos vid tidpunkten för transfection. Detta minskar antalet transfekterade celler vävnad1,4. Specifikt är transfection av vävnader med svag Mitos aktivitet, till exempel hjärtats celler, svår5. I motsats till pDNA förekommer den transfection och översättning av mRNA i mitotiska och icke-mitotiska celler i vävnad1,6. Viral integrering av DNA i värd genomet kan komma med mutagena effekter eller immuna reaktioner7,8, men efter transfection av celler med en protein-encoding mRNA, de novo syntesen av proteinet önskad börjar självständigt9,10. Proteinsyntesen kan dessutom justeras exakt till patientens behov genom individuella doser, utan stör genomet och riskera mutagena effekter11. Immun-aktiverande potential av syntetiskt genererade mRNA kan sänkas dramatiskt med hjälp av pseudo uridin och 5′-methylcytidine istället för uridin och cytidin12. Pseudo uridin modifierade mRNA har också visat sig ha en ökad biologisk stabilitet och en betydligt högre translationell kapacitet13.
För att kunna dra nytta av de lovande egenskaperna av mRNA-baserad terapi i kliniska tillämpningar, är det viktigt att skapa ett lämpligt fordon för transport av mRNA in i cellen. Detta fordon bör bära icke-toxiska egenskaper in vitro- och in-vivo, skydda mRNA mot nuclease-nedbrytning och ge tillräcklig cellernas upptag för en långvarig tillgänglighet och översättning av mRNA14.
Bland alla möjliga bärare typer för i vivo drogen leverans, såsom kolnanorör, kvantprickar och liposomer, den senare har studerat de15,16. Liposomer är blåsor bestående av en lipid lipidens10. De är amfifila med en hydrofob och en hydrofil avsnitt, och genom egen arrangemanget av dessa molekyler, är en sfärisk dubbla lager bildas17. Inuti liposomer, kan terapeutiska medel eller läkemedel vara inkapslade och således skyddas från enzymatisk nedbrytning18. Liposomer innehållande N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium klorid (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20, och dioctadecylamidoglycylspermine (hundar)21, eller DC-kolesterol22, är väl karakteriserade och ofta används för cellulära transfection med DNA eller RNA.
Katjoniska liposomer består av en positivt laddad lipid och en oladdad fosfolipid23. Transfection via katjoniska liposomer är en av de vanligaste metoderna för transport av nukleinsyror in celler24,25. Katjoniska lipid partiklarna bildar komplex med de negativt laddade fosfatgrupper i ryggraden i nukleinsyra molekyler26. Dessa så kallade lipoplexes fäster på ytan av cellmembranet och in i cellen via endocytos eller endocytos-liknande-mekanismer27.
I 1989, Malone et al. framgångsrikt beskrivs katjoniska lipid-medierad mRNA transfection28. Dock fann använder en blandning av DOTMA och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (knark), gruppen att DOTMA manifesterade cytotoxiska effekter28. Zohra et al. visade dessutom att DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimetylammoniumformiat-propan klorid) kan användas som en mRNA transfection reagens29. Dock för den effektiva transfection celler, bör DOTAP användas i kombination med andra reagens, såsom Fibronektin29 eller knark30. Hittills, var DOTMA den första katjoniska lipid på marknaden används för gen leverans31. Andra lipider används som terapeutiska bärare eller har testats i olika stadier av kliniska prövningar (t.ex. EndoTAG-I, innehållande DOTAP som lipid bärare), undersöks för närvarande i en fas-II klinisk prövning32.
Detta arbete beskriver ett protokoll för generering av NLps innehållande DC-kolesterol och knark. Denna metod är enkel att utföra och tillåter generering av NLps olika storlekar. Det generella målet för NLp generation med torr-film-metoden är att skapa liposomer för mRNA komplexering, vilket möjliggör effektiv och biokompatibla cell transfection in vitro-14,33.
Presenterade protokollet beskriver generationen NLps med hög inkapsling effekt för syntetiskt modifierade mRNA, liksom den pålitliga transfection av celler in vitro. Dessutom garanterar NLps frisläppandet av mRNA, som i sin tur översätts till ett funktionellt protein inne i cellerna. Dessutom de transfections som använder NLps kan utföras i regelbunden cell medium, vilket resulterar i hög cell förmåga under transfection, och pågå upp till tre dagar efter transfection.
Fö…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |