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Bioengenharia

Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de In Vitro transcrit l’ARN messager

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

Ici nous décrivons un protocole pour la génération de nanoliposomes cationiques, qui repose sur la méthode sèche-film et peut être utilisé pour la sécurité et la prestation efficace de in vitro transcrit l’ARN messager.

Abstract

Le développement de l’ARN messager (ARNm)-fonction thérapeutique pour le traitement de diverses maladies devient plus important à cause de la positive propriétés de in vitro transcrit mRNA (IVT). Avec l’aide de l’ARNm de l’IVT, la synthèse de novo d’une protéine désirée peut être induite sans changer l’état physiologique de la cellule cible. En outre, biosynthèse des protéines peut être contrôlée avec précision en raison de l’effet transitoire du mRNA IVT.

Pour la transfection efficace des cellules, nanoliposomes (PNV) peut représenter un véhicule de livraison sûre et efficace pour l’ARNm thérapeutique. Cette étude décrit un protocole pour générer sûre et efficace cationique PNV composée de DC-cholestérol et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) comme un vecteur de livraison d’ARNm IVT. PNV ayant une taille, une répartition homogène et une capacité élevée de complexation et peut être produites à l’aide de la méthode sèche-film. Par ailleurs, nous présentons des systèmes de test différent afin d’analyser leur complexation et efficacité de transfection utilisant synthétique renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) mRNA, ainsi que leur effet sur la viabilité des cellules. Globalement, le protocole présenté fournit une approche efficace et sans danger pour la complexation d’ARNm, qui peut faire avancer et améliorer l’administration de l’ARNm thérapeutique.

Introduction

L’utilisation du mRNA modifiés pour des applications thérapeutiques a montré beaucoup de potentiel dans les deux dernières années. Maladies cardiovasculaires, inflammatoires et monogénique, ainsi que dans le développement de vaccins, l’ARNm est agent thérapeutique prometteur1.

Thérapie de remplacement de protéines avec l’ARNm offre plusieurs avantages sur la thérapie génique classique, qui repose sur la transfection d’ADN dans les cellules de cible2. La fonction ARNm lance directement dans le cytosol. Bien que le plasmide ADN (pDNA), une construction de double-brin, circulaire ADN contenant une région promotrice et une séquence de gène codant pour la protéine thérapeutique3, également des actes dans le cytosol, il peut seulement être incorporé dans les cellules qui traversent la mitose au moment de la transfection. Cela réduit le nombre de cellules transfectées dans le tissu1,4. Plus précisément, la transfection des tissus ayant une activité faible mitose, telles que les cellules cardiaques, est difficile5. Contrairement à pDNA, la transfection et la traduction des ARNm produisent dans les cellules mitotiques et non-mitotique dans le tissu1,6. L’intégration virale d’ADN dans le génome hôte peut venir avec des effets mutagènes ou réactions immunitaires7,8, mais après la transfection de cellules avec un ARNm codant des protéines, la synthèse de novo de la protéine désirée commence de manière autonome9,10. En outre, la synthèse des protéines peut être ajustée précisément au besoin du patient par le biais de doses individuelles, sans interférer avec le génome et risquer des effets mutagènes11. Le potentiel d’activation immunitaire des ARNm synthétiquement généré pourrait être considérablement réduit en utilisant des pseudo-uridine et 5′-méthylcytidine au lieu de l’uridine et cytidine12. Pseudo-uridine, mis à jour le mRNA a également été montré pour avoir une meilleure stabilité biologique et une significativement plus élevée capacité translationnelle13.

Pour pouvoir bénéficier des propriétés prometteuses de la thérapie axée sur les ARNm en applications cliniques, il est essentiel de créer un véhicule adapté pour le transport de l’ARNm dans les cellules. Ce véhicule devrait porter non toxique propriétés in vitro et in vivo, de protéger l’ARNm contre la nucléase-dégradation et fournir absorption cellulaire suffisante pour une disponibilité prolongée et la traduction de l’ARNm de14.

Parmi tous les types de support possible pour in vivo l’administration de médicaments, tels que les nanotubes de carbone, points quantiques et liposomes, ces derniers ont été étudiées les plus de15,16. Liposomes sont des vésicules constituée d’une bicouche de lipides10. Ils sont amphiphiles comporte un hydrophobe et une partie hydrophile, et grâce à l’entente autonome de ces molécules, une double couche sphérique est formé de17. Dans les liposomes, agents thérapeutiques ou drogues peuvent encapsulés et, ainsi, protégés de dégradation enzymatique18. Liposomes contenant N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chlorure (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(triméthylammonio) propane] (DOTAP)20et21de dioctadecylamidoglycylspermine (chiens), ou DC-cholestérol22, sont bien caractérisées et fréquemment utilisé pour la transfection cellulaire avec l’ADN ou d’ARN.

Les liposomes cationiques forment un lipide chargé positivement et un phospholipide sans inculpation23. La transfection par l’intermédiaire des liposomes cationiques est l’une des méthodes plus courantes pour le transport d’acides nucléiques dans des cellules24,25. Les particules de lipide cationique forment des complexes avec les groupes phosphates chargés négativement dans le squelette de l’acide nucléique molécules26. Ces soi-disant lipoplexes fixent à la surface de la membrane cellulaire et entrer dans la cellule par endocytose ou endocytose-mécanismes27.

En 1989, Malone et al. avec succès décrits médiée par les lipides cationiques ARNm transfection28. Toutefois, à l’aide d’un mélange de DOTMA et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), le groupe a estimé que DOTMA manifeste des effets cytotoxiques28. En outre, Zohra et coll. ont montré que DOTAP (chlorure de 1, 2-dioleoyloxy-3-triméthylammonium-propane) peut être utilisé comme un ARNm transfection réactif29. Toutefois, pour la transfection efficace des cellules, DOTAP doit être utilisé en combinaison avec d’autres réactifs, tels que la fibronectine29 ou30de la DOPE. Jusqu’à présent, DOTMA a été le premier lipide cationique sur le marché utilisé pour la livraison de gène31. Autres lipides sont utilisées comme supports thérapeutiques ou sont actuellement testés à différents stades d’essais cliniques (p. ex., EndoTAG-I, contenant DOTAP comme un transporteur de lipides), est actuellement à l’étude dans un essai clinique de phase II32.

Cet ouvrage décrit un protocole pour la génération du PNV contenant DC-cholestérol et DOPE. Cette méthode est facile à réaliser et permet la génération du PNV de différentes tailles. L’objectif général de génération de PNL à l’aide de la méthode sèche-film est de créer des liposomes pour la complexation de l’ARNm, ce qui permet de transfection de cellules efficace et biocompatible en vitro14,33.

Protocol

1. génération de Nanoliposomes cationique (Figure 1) Dissoudre les lipides DC-cholestérol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholestérol chlorhydrate) et DOPE (dioléoyl phosphatidyléthanolamine), livrés sous forme de poudre, dans le chloroforme à une concentration finale de 25 mg/mL.Note : Stocker les lipides dissous à-20 ° C. Travailler avec 25 mg/mL de solution de ces deux lipides. Mix 40 µL de la DC-cholestérol dissous et 80 µL de la D…

Representative Results

En utilisant le protocole comme décrit, PNV consistant en des lipides DC-cholestérol et DOPE ont été préparés selon la méthode de sec-film (Figure 1). Pendant la préparation, la solution de nanoliposome montre différentes étapes de la turbidité (Figure 2). L’efficacité de l’encapsulation de la PNV peut ensuite être analysée après l’encapsulation de …

Discussion

Le protocole présenté décrit la génération du PNV avec efficacité d’encapsulation élevée d’ARNm synthétiquement mis à jour le, ainsi que la fiabilité transfection des cellules in vitro. En outre, le PNV garantie la libération des ARNm, qui à son tour, est traduit en une protéine fonctionnelle à l’intérieur des cellules. En outre, les transfections utilisant le PNV peut être effectuée dans un milieu ordinaire cellulaire, résultant en grande viabilité de cellules au cours de la transfecti…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Aucun

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
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Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
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