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Bioengenharia

के कुशल वितरण के लिए Cationic Nanoliposomes की जनरेशन इन विट्रो प्रतिलिखित दूत आरएनए

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

यहाँ हम cationic nanoliposomes की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, जो शुष्क फिल्म पद्धति पर आधारित है और इन विट्रो में के सुरक्षित और कुशल वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

विभिन्न रोगों के उपचार के लिए दूत आरएनए (mRNA) आधारित चिकित्सीय चिकित्सा के विकास में अधिक से अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है क्योंकि इन विट्रो प्रतिलिखित (IVT) mRNA के सकारात्मक गुणों की. IVT mRNA की मदद के साथ, एक वांछित प्रोटीन के de नोवो संश्लेषण लक्ष्य कोशिका की शारीरिक स्थिति को बदलने के बिना प्रेरित किया जा सकता है । इसके अलावा, IVT mRNA के परिवर्तनीय प्रभाव के कारण प्रोटीन का संश्लेषण ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है ।

कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए, nanoliposomes (NLps) चिकित्सीय mRNA के लिए एक सुरक्षित और कुशल प्रसव वाहन का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इस अध्ययन के एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सुरक्षित और कुशल cationic उत्पंन NLps डीसी से मिलकर कोलेस्ट्रॉल और 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (डोप) IVT mRNA के लिए एक प्रसव के लिए सदिश के रूप में । NLps एक निर्धारित आकार, एक सजातीय वितरण, और एक उच्च रंग क्षमता है, और शुष्क फिल्म विधि का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता है । इसके अलावा, हम विभिंन परीक्षण प्रणालियों वर्तमान के लिए उनके रंग और अभिकर्मक सिंथेटिक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) mRNA, साथ ही साथ सेल व्यवहार्यता पर अपने प्रभाव का उपयोग efficacies का विश्लेषण । कुल मिलाकर, प्रस्तुत प्रोटोकॉल mRNA परिसर के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित दृष्टिकोण है, जो अग्रिम और चिकित्सीय mRNA के प्रशासन में सुधार कर सकते है प्रदान करता है ।

Introduction

चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए संशोधित mRNA के उपयोग के पिछले कुछ वर्षों में महान क्षमता दिखाया गया है । हृदय, भड़काऊ, और monogenetic रोगों, साथ ही टीके के विकास में, mRNA एक होनहार चिकित्सकीय एजेंट1है ।

mRNA के साथ प्रोटीन रिप्लेसमेंट थेरेपी शास्त्रीय जीन थेरेपी, जो लक्ष्य कोशिकाओं2में डीएनए अभिकर्मक पर आधारित है पर कई लाभ प्रदान करता है । mRNA फ़ंक्शन सीधे cytosol में प्रारंभ करता है । हालांकि प्लाज्मिड डीएनए (pDNA), एक प्रमोटर क्षेत्र और चिकित्सीय प्रोटीन3एंकोडिंग एक जीन अनुक्रम युक्त दोहरे-असहाय, परिपत्र डीएनए का निर्माण, यह भी cytosol में कार्य करता है, यह केवल कोशिकाओं में शामिल किया जा सकता है जो बँटवारा के माध्यम से जा रहे हैं के समय अभिकर्मक । यह ऊतक1,4में transfected कोशिकाओं की संख्या कम कर देता है । विशेष रूप से, हृदय कोशिकाओं के रूप में कमजोर बँटवारा गतिविधि के साथ ऊतकों की अभिकर्मक, मुश्किल है5. pDNA के विपरीत, ऊतक1,6में mitotic और गैर mitotic कोशिकाओं में mRNA के अभिकर्मक और अनुवाद होते हैं । डीएनए के वायरल एकीकरण मेजबान जीनोम में mutagenic प्रभाव या प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ आ सकता है7,8, लेकिन एक प्रोटीन के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद mRNA एन्कोडिंग, वांछित प्रोटीन के de नोवो संश्लेषण 9,10autonomously शुरू होता है । इसके अलावा, प्रोटीन संश्लेषण ठीक व्यक्तिगत खुराक के माध्यम से रोगी की जरूरत के लिए समायोजित किया जा सकता, जीनोम के साथ हस्तक्षेप के बिना और mutagenic प्रभाव11खतरे में डाल. सिंथेटिक जनित mRNA की प्रतिरक्षा सक्रिय क्षमता नाटकीय रूप से छद्म uridine और 5 ‘-methylcytidine के बजाय uridine और cytidine12का उपयोग करके कम किया जा सकता है । छद्म uridine संशोधित mRNA भी एक वृद्धि हुई जैविक स्थिरता और एक काफी उच्च अनुवाद क्षमता13दिखाया गया है ।

नैदानिक अनुप्रयोगों में mRNA आधारित चिकित्सा के होनहार गुणों से लाभ के लिए सक्षम होने के लिए, यह सेल में mRNA के परिवहन के लिए एक उपयुक्त वाहन बनाने के लिए आवश्यक है । इस वाहन को इन विट्रो में और vivoमें गैर विषैले गुण सहन करना चाहिए, nuclease-क्षरण के खिलाफ mRNA की रक्षा, और एक लंबे समय तक उपलब्धता और mRNA14के अनुवाद के लिए पर्याप्त सेलुलर प्रदान करते हैं ।

इस तरह के कार्बन नैनोट्यूब, क्वांटम डॉट्स, और liposomes के रूप में vivo दवा वितरण में के लिए सभी संभव वाहक प्रकार, के अलावा सबसे अधिक15,16का अध्ययन किया गया है । Liposomes एक लिपिड bilayer10से मिलकर बुलबुले हैं । वे एक hydrophobic और एक हाइड्रोफिलिक धारा के साथ amphiphilic हैं, और इन अणुओं की आत्म व्यवस्था के माध्यम से, एक गोलाकार डबल परत17बनाई गई है । liposomes के अंदर, चिकित्सीय एजेंटों या दवाओं और समझाया जा सकता है, इस प्रकार, एंजाइमी गिरावट18से संरक्षित । Liposomes युक्त n-[1-(2, 3-dioleyloxy) propyl]-n, n, n-trimethylammonium क्लोराइड (DOTMA)19, [1, 2-भा (oleoyloxy)-3-(trimethylammonio) प्रोपेन] (DOTAP)20, और dioctadecylamidoglycylspermine (कुत्ते)21, या डीसी-कोलेस्ट्रॉल22, अच्छी तरह से विशेषता और अक्सर डीएनए या आरएनए के साथ सेलुलर अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ।

Cationic liposomes एक सकारात्मक आरोप लगाया लिपिड और एक unchargeed फॉस्फोलिपिड23शामिल हैं । अभिकर्मक via cationic liposomes24,25कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड के परिवहन के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है । cationic लिपिड कणों न्यूक्लिक एसिड अणुओं की रीढ़26में नकारात्मक आरोप फॉस्फेट समूहों के साथ परिसरों के रूप में । ये तथाकथित lipoplexes कोशिका झिल्ली की सतह के लिए संलग्न है और endocytosis या endocytosis के माध्यम से सेल दर्ज करें-जैसे तंत्र27।

१९८९ में, मेलोन एट अल. सफलतापूर्वक वर्णित cationic लिपिड मध्यस्थता mRNA अभिकर्मक28. हालांकि, DOTMA और 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (डोप) के मिश्रण का उपयोग करते हुए, समूह ने पाया कि DOTMA अमानत साइटोटोक्सिक प्रभाव28. साथ ही, ज़ोहरा एट अल. दिखाया गया है कि DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-प्रोपेन क्लोराइड) एक mRNA अभिकर्मक29एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए, DOTAP अन्य रिएजेंट के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जैसे fibronectin29 या डोप30. अब तक DOTMA का जीन डिलिवरी31के लिए इस्तेमाल होने वाला बाजार पर पहला cationic लिपिड था । अन्य लिपिड चिकित्सीय वाहक के रूप में उपयोग किया जाता है या नैदानिक परीक्षणों के विभिन्न चरणों में परीक्षण किया जा रहा है, (जैसे, EndoTAG-I, एक लिपिड वाहक के रूप में DOTAP युक्त), वर्तमान में एक चरण द्वितीय नैदानिक परीक्षण३२में जांच की जा रही है.

यह काम डीसी युक्त NLps की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-कोलेस्ट्रॉल और डोप । इस विधि से प्रदर्शन करने के लिए आसान है और विभिंन आकारों की NLps की पीढ़ी की अनुमति देता है । एनएलपी पीढ़ी के सामांय लक्ष्य शुष्क फिल्म विधि का उपयोग करने के लिए mRNA रंग के लिए liposomes बना है, इस प्रकार की अनुमति कुशल और अभिकर्मक इन विट्रो मेंसंगत सेल14,३३।

Protocol

1. Cationic Nanoliposomes की जनरेशन (चित्रा 1) लिपिड डीसी भंग-कोलेस्ट्रॉल (3β-[n-(n ′, N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] कोलेस्ट्रॉल हाइडरोक्लॉराइड) और डोप (dioleoyl phosphatidylethanolamine), एक पाउडर के रूप में दिया, क्लोरोफॉर्म में एक अंतिम एकाग्रत?…

Representative Results

वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल का प्रयोग, लिपिड डीसी से मिलकर कोलेस्ट्रॉल और डोप शुष्क फिल्म विधि (चित्रा 1) का उपयोग कर तैयार किया गया NLps । तैयारी के दौरान, nanoliposome समाधान turbidity (चि…

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल सिंथेटिक संशोधित mRNA के लिए उच्च encapsulation प्रभावकारिता के साथ NLps की पीढ़ी का वर्णन, साथ ही साथ इन विट्रो मेंकोशिकाओं के विश्वसनीय अभिकर्मक. इसके अलावा, NLps mRNA, जो बारी में, कोशिकाओं के अंद?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

कोई

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
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Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
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