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Bioengenharia

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA を転写しました。

Abstract

メッセンジャー RNA (mRNA) の開発-正のため様々 な疾患の治療がより重要になる治療法に基づく体外のプロパティ (IVT) mRNA の転写。IVT mRNA の助けを借りて、ターゲット細胞の生理的状態を変更せず目的タンパク質のde novo合成を誘導することができます。さらに、蛋白質の生合成は、IVT mRNA の一時的な効果により正確に制御できます。

細胞の効率的な遺伝子導入の nanoliposomes (NLps) 治療 mRNA の安全かつ効率的な配信手段があります。本研究では、IVT mRNA の配信ベクトルとして安全かつ効率的なカチオン NLps DC コレステロールと 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine で構成される (ドープ) を生成するプロトコルについて説明します。定義を持つ NLps のサイズ、均一な分布と高錯形成能力とドライ フィルム法を使用して作り出すことができます。また、錯を分析するさまざまなテスト システムを提案し、トランスフェクションの効率、合成を使用して強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) mRNA として細胞生存率に及ぼす影響。全体的にみて、提案するプロトコルは進めるし、治療 mRNA の管理を向上させる可能性のある mRNA の錯形成の効果的かつ安全なアプローチを提供します。

Introduction

治療への応用のため変更された mRNA の使用は最後の数年間で大きな可能性を示しています。心血管、炎症性、複成火山と疾患だけでなく、ワクチンの開発には、mRNA は有望な治療剤1です。

MRNA とタンパク質補充療法では、ターゲット セル2に DNA トランスフェクションに基づいている古典的な遺伝子療法にいくつかの利点を提供しています。MRNA 関数は、細胞質に直接開始します。プラスミド DNA (pDNA)、二本鎖の構築、円形がプロモーター領域および治療用タンパク質3、細胞質でも行為をエンコードする遺伝子の塩基配列を含む DNA それだけに組み込むことが細胞分裂している細胞トランスフェクション時。これは組織1,4transfected セルの数を減らします。具体的には、心筋細胞などの弱い細胞分裂活性を持つ組織の導入は困難な5です。PDNA と対照をなして、トランスフェクションと mRNA の翻訳は組織1,6の分裂と非分裂細胞で発生します。変異原性、または免疫反応7,8が蛋白質符号化の mRNA、目的タンパク質のde novo合成と細胞のトランスフェクション後、宿主ゲノムへの DNA のウイルスの統合が来るかもしれない9,10を自律的に起動します。さらに、タンパク質合成は、ゲノムと干渉や変異原効果11を危険にさらすことがなく個々 の用量で患者のニーズに正確に調整できます。シチジン、ウリジンの12の代わりに擬似ウリジンと 5′-methylcytidine を使用して総合的に生成された mRNA の免疫活性化の可能性を大幅に下げることができます。擬似ウリジン変更された mRNA は、生物学的安定性と有意に高い翻訳能力13に示されています。

臨床応用における mRNA ベース療法の有望なプロパティから利益を得ることができる、セルに mRNA の輸送に適した車両を作成することが不可欠です。この車必要があります非毒性特性の in vitroとin vivoの負担、ヌクレアーゼ劣化に対する mRNA を保護し、十分な細胞内取り込みは、長期にわたる可用性と14の mRNA の翻訳。

薬物送達など単層カーボンナノ チューブ量子ドットのリポソームは、体内のすべての可能なキャリア タイプの間で後者をされている最も15,16を検討しました。リポソームは、10脂質二分子膜からなる小胞。彼らは、疎水性と親水性部分を持つ両親媒性であり、これらの分子の自己整理、球形の二重層が形成された17。リポソーム、内部治療薬または薬カプセル化でき、したがって、酵素分解18から保護します。N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium 塩化物 (DOTMA)19リポソーム [1, 2-ビス (oleoyloxy)-3-(トリメチルアンモニオ-) プロパン] (DOTAP)20、および dioctadecylamidoglycylspermine (犬)21、またはDC コレステロール22、よく特徴があり、DNA または RNA の細胞のトランスフェクションの頻繁に使用されます。

カチオン性リポソームは、正荷電脂質および中性リン脂質23を構成します。カチオン性リポソームによる遺伝子導入細胞24,25に核酸の輸送のための最も一般的な方法であります。カチオン性脂質粒子は、核酸分子26のバックボーンに負荷電の隣酸塩グループと複合体を形成します。これらのいわゆるリポプレックスは細胞膜の表面に添付し、エンドサイトーシス、エンドサイトーシスようなメカニズム27セルを入力します。

1989 年、マローンら。正常にカチオン性脂質を介した mRNA トランスフェクション28をについて説明します。しかし、DOTMA と 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ドープ) 混合物を使用すると、グループは、DOTMA が細胞毒性28を明示されることを発見しました。また、Zohraらは、mRNA のトランスフェクション試薬29として DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-トリメチル アンモニウム-プロパン塩化ビニル) を使用できることを示した。ただし、細胞の効率的な遺伝子導入の DOTAP をフィブロネクチン29やドープ30など、その他の試薬との組み合わせで使用してください。これまでのところ、DOTMA は遺伝子配達31用市場で最初のカチオン性脂質です。他脂質治療キャリアとして使用されるまたは、臨床試験のさまざまな段階でテストされている (例えば、EndoTAG-私は、脂質キャリアとして DOTAP を含む)、フェーズ II 臨床試験32で現在調査中です。

この作品は、DC コレステロールと麻薬を含む NLps の世代のプロトコルを説明します。このメソッドを実行するは簡単です、サイズの異なる NLps の生成が可能します。ドライ フィルム法による NLp 世代の一般的な目標は、効率的かつ生体適合性細胞の in vitro14,トランスフェクション33をできるように、mRNA に対するリポソームを作成します。

Protocol

1. カチオン性 Nanoliposomes (図 1) の生成 DC コレステロール (3-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) カルバモイルリン] コレステロール塩酸) とドープ (dioleoyl ホスファチジルエタノールアミン) クロロホルム 25 mg/mL の最終的な集中を達成するために、粉末として提供される脂質を溶解します。注: 保存-20 ° C で分解された脂質 両方の脂質の 25 mg/mL 原液で動作します。…

Representative Results

前述のプロトコルを使用して、DC コレステロールおよびドープ脂質から成る NLps ドライ フィルム法 (図 1) を使用してを調製しました。準備中、nanoliposome ソリューションは、濁度 (図 2) のさまざまな段階を示しています。 NLps のカプセル化の効果は、無料 RNA 定量キット (<strong c…

Discussion

提案するプロトコルでは、総合的に変更された mrna は、高い封止効果 NLps の世代だけでなく、細胞の in vitroの信頼性の高いトランスフェクションをについて説明します。また、NLps mRNA は、ターンでは、細胞内タンパク質に翻訳はのリリースを保証します。さらに、NLps を使用して transfections 通常細胞培地で行うことが、高の結果セルの目をトランスフェクション効率を促進し、最後ト?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

どれも

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
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Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
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