JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioengenharia

Generering av kationisk Nanoliposomes for effektiv levering av In Vitro transkribert budbringer RNA

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

Her beskriver vi en protokoll for generering av kationisk nanoliposomes, som er basert på metoden tørrfilm og kan brukes for trygg og effektiv levering av in vitro transkribert budbringer RNA.

Abstract

Utviklingen av budbringer RNA (mRNA)-basert therapeutics for behandling av ulike sykdommer blir stadig viktigere på grunn av positive egenskapene til i vitro transkribert (PES) mRNA. Med hjelp av IVT mRNA, kan de novo syntesen av et protein som ønsket indusert uten endring av fysiologiske status for målcellen. Videre kan protein biosyntesen kontrolleres nøyaktig på grunn av forbigående effekten av IVT mRNA.

For effektiv transfection celler, kan nanoliposomes (NLps) representere en sikker og effektiv levering kjøretøy for terapeutisk mRNA. Denne studien beskriver en protokoll for å generere sikker og effektiv kationisk NLps bestående av DC-kolesterol og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (dop) som en vektor for levering for IVT mRNA. NLps har en definert størrelse, en homogen distribusjon og en høy complexation kapasitet, og kan produseres med metoden tørrfilm. Videre vi presenterer ulike testsystemer å analysere sine complexation og hva efficacies bruker syntetiske forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP) mRNA, samt deres innvirkning på celle levedyktighet. Samlet gir presentert protokollen en effektiv og trygg tilnærming for mRNA complexation, som kan fremme og forbedre administrasjonen av terapeutiske mRNA.

Introduction

Bruk av modifisert mRNA for terapeutiske programmer har vist stort potensial i de siste par årene. I hjerte, provoserende og monogenetic sykdommer og utvikle vaksiner, er mRNA en lovende terapeutisk agent1.

Protein erstatning terapi med mRNA tilbyr flere fordeler sammenlignet med den klassiske genterapi, som er basert på DNA hva til målet celler2. Funksjonen mRNA starter direkte i stoffer. Men plasmider DNA (pDNA), en konstruksjon av double-strandet, rund kan DNA som inneholder en promoter region og gene serie koding terapeutiske protein3, også handlinger i stoffer det bare inkluderes i celler som går gjennom mitose ved transfection. Dette reduserer antall transfekterte celler i vevet1,4. Hva av vev med svak mitose aktivitet, for eksempel hjerte celler, er spesielt vanskelig5. I motsetning til pDNA oppstår hva og oversettelse av mRNA i mitotisk og ikke-mitotisk celler i vevet1,6. Viral integrering av DNA i vert genomet kan komme med mutagene effekter eller immunreaksjoner7,8, men etter hva av celler med en protein-koding mRNA, ønsket protein syntese de novo starter selvstendig9,10. Videre kan proteinsyntese justeres til pasientens behov gjennom personlige doser, uten å forstyrre genomet og risikere mutagene effekter11. Aktivering av immun potensialet i syntetisk genererte mRNA kunne reduseres dramatisk med pseudo uridine og 5-methylcytidine i stedet for uridine og cytidine12. Pseudo uridine endret mRNA har også vist seg å ha en økt biologiske stabilitet og en betydelig høyere translasjonsforskning kapasitet13.

For å kunne dra nytte av de lovende egenskapene av mRNA-basert behandling av klinisk bruk, er det viktig å lage en passende bil for transport av mRNA inn i cellen. Dette kjøretøyet skal bære giftfri egenskaper i vitro og vivo, beskytte mRNA mot nuclease-degradering og gi tilstrekkelig mobilnettet opptak for en langvarig tilgjengelighet og oversettelse av de mRNA14.

Blant alle mulige transportør typer i vivo stoffet levering, som Karbonnanorør kvante prikker og liposomer, sistnevnte har vært studert de15,16. Liposomer er blemmer som består av en lipid bilayer10. De er amphiphilic med en hydrofobe og en hydrofile del, og selv hvordan disse molekylene, et sfærisk dobbelt lag er dannet17. I liposomer, kan terapeutiske agenter eller narkotika være innkapslet og dermed beskyttet enzymatisk degradering18. Liposomer inneholder N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20, og dioctadecylamidoglycylspermine (hunder)21, eller DC-kolesterol22, er vel preget og brukte for mobilnettet transfection med DNA eller RNA.

Kationisk liposomer utgjør en positivt ladet lipid og en uncharged phospholipid23. Hva via kationisk liposomer er en av de vanligste metodene for transport av nukleinsyrer til celler24,25. Kationisk lipid partikler danner komplekser med negativt ladde fosfat grupper i ryggraden i nukleinsyre molekyler26. Disse såkalte lipoplexes legge til overflaten av cellemembranen og angi cellen gjennom endocytose eller endocytose-lignende-mekanismer27.

I 1989, Malone et al. vellykket beskrevet kationisk lipid-formidlet mRNA transfection28. Men fant bruker en blanding av DOTMA og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (dop), gruppen at DOTMA manifestert cytotoksiske effekter28. I tillegg viste Zohra et al. at DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propan klorid) kan brukes som en mRNA transfection reagens29. Men for den effektive transfection celler, bør DOTAP brukes i kombinasjon med andre reagenser, som fibronectin29 eller DOPE30. Så langt var DOTMA den første kationisk lipid på markedet brukes for gen levering31. Andre lipider brukes som terapeutiske bærere eller blir testet i ulike stadier av kliniske forsøk, (f.eks EndoTAG-I, som inneholder DOTAP som en lipid bærer), undersøkes for tiden i en fase II kliniske prøve32.

Dette verket beskriver en protokoll for generering av NLps som inneholder DC-kolesterol og dop. Denne metoden er enkel å utføre og tillater generering av NLps av forskjellige størrelser. Vårt generelle mål om NLp generasjon med metoden tørrfilm er å skape liposomer for mRNA complexation, dermed gir effektiv og biokompatible celle transfection i vitro14,33.

Protocol

1. generasjon av kationisk Nanoliposomes (figur 1) Oppløse lipider DC-kolesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] kolesterol hydroklorid) og dop (dioleoyl phosphatidylethanolamine), som et pulver i kloroform å oppnå en siste konsentrasjon av 25 mg/mL.Merk: Oppbevar de oppløste lipider på 20 ° C. Arbeide med 25 mg/mL lagerløsning av både lipider. Mix 40 µL av oppløst DC-kolesterol og 80 µL av oppløst dop i en glass kolbe.Merk: Totalt l…

Representative Results

Ved hjelp av protokollen som beskrevet, var NLps bestående av lipider DC-kolesterol og dop forberedt med metoden tørrfilm (figur 1). Under utarbeidelse viser den nanoliposome løsningen ulike stadier i turbiditet (figur 2). Innkapsling effekten av NLps kan deretter analyseres etter innkapsling av 1 µg av eGFP-koding mRNA ved å analysere gratis mengden mRNA, som ikke…

Discussion

Presentert protokollen beskriver generasjonen av NLps med høy innkapsling virkningen for syntetisk endret mRNA og pålitelig transfection celler i vitro. Videre garanterer NLps utgivelsen av mRNA, som igjen oversettes til en funksjonell protein i cellene. I tillegg transfections ved hjelp av NLps kan utføres i vanlig celle medium, som resulterer i høy celle viabilities under transfection og sist opp til tre dager etter hva.

For å bruke mRNA som en terapeutisk, foretrekkes selvsten…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ingen

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics–developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don’t shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -. K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -. P., Krajewski, S., Kormann, M. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. , 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. “In vivo” distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

Tags

Cationic NanoliposomesMRNA DeliveryTransfectionNanoparticleLipid FilmExtrusionNanolipoplexA549 Cells
check_url/pt/58444?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image