Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.
El desarrollo de RNA mensajero (mRNA)-base terapéutica para el tratamiento de diversas enfermedades, se convierte cada vez más importante debido a la positiva propiedades de in vitro transcripción mRNA (IVT). Con la ayuda de mRNA IVT, puede inducirse la síntesis de novo de una proteína deseada sin necesidad de cambiar el estado fisiológico de la célula diana. Por otra parte, biosíntesis de la proteína pueden ser precisamente controlada debido al efecto transitorio del mRNA IVT.
Para la transfección eficiente de células, nanoliposomas (NLps) pueden representar un vehículo de entrega segura y eficiente para el mRNA terapéutico. Este estudio describe un protocolo para generar seguro y eficiente catiónico NLps compuesto de colesterol DC y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como un vector de la entrega para IVT mRNA. NLps tener definido el tamaño, una distribución homogénea y una capacidad de complejación alta y puede ser producidos utilizando el método de película seca. Por otra parte, presentamos sistemas de prueba diferentes para analizar la complejación y eficacias de transfección con sintético mejorado proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, así como su efecto en la viabilidad celular. En general, el protocolo presentado proporciona un acercamiento eficaz y seguro para la complejación de mRNA, que puede avanzar y mejorar la administración de terapéutica mRNA.
El uso de ARNm modificado para aplicaciones terapéuticas ha mostrado gran potencial en los últimos años. En enfermedades cardiovasculares, inflamatorias y monogenéticos, así como en el desarrollo de vacunas, el mRNA es un prometedor agente terapéutico1.
Terapia de reemplazo de la proteína con el mRNA ofrece varias ventajas sobre la terapia del gene clásico, basado en la transfección de la DNA en las células de destino2. La función de mRNA se inicia directamente en el citosol. Aunque el plásmido ADN (pDNA), una construcción de doble cadena, circular ADN que contiene una región promotora y una secuencia del gen que codifican la proteína terapéutica3, también actúa en el citosol, puede sólo ser incorporado en células que van a través de la mitosis en el momento de la transfección. Esto reduce el número de células transfected en el tejido1,4. Específicamente, la transfección de los tejidos con actividad de mitosis débiles, tales como células cardíacas, es difícil5. En contraste con pDNA, la transfección y traducción de mRNA ocurren en las células mitotic y no mitótica del tejido1,6. La integración viral de la DNA en el genoma del anfitrión puede venir con efectos mutagénicos o reacciones inmunes7,8, pero después de la transfección de células con una codificación de la proteína ARNm, la síntesis de novo de la proteína deseada inicia autónomamente9,10. Por otra parte, la síntesis de proteínas puede ajustarse precisamente a la necesidad del paciente a través de dosis individuales, sin interferir en el genoma y correr el riesgo de efectos mutagénicos11. El potencial de activación inmune de mRNA sintético generado podría reducirse drásticamente mediante pseudo uridina y 5′-methylcytidine en lugar de uridina y citidina12. Pseudo uridina mRNA modificada también se ha demostrado tener una mayor estabilidad biológica y una significativamente mayor capacidad traslacional13.
Para poder beneficiarse de las prometedoras propiedades de tratamiento basado en el mRNA en aplicaciones clínicas, es esencial para crear un vehículo adecuado para el transporte de ARNm en la célula. Este vehículo debe tener propiedades no tóxico en vitro e in vivo, proteger el mRNA contra degradación nucleasas y proporcionar suficiente absorción celular para una prolongada disponibilidad y traducción de los mRNA de14.
Entre todos los tipos de portador posible para en vivo entrega de la droga, tales como nanotubos de carbono puntos cuánticos y liposomas, estos últimos han sido estudiados más de15,16. Liposomas son vesículas que consiste en una bicapa de lípidos10. Son anfifílicas con una hidrofóbica y una hidrofílica sección, y a través de la propia disposición de estas moléculas, una doble capa esférica es formado17. Dentro de los liposomas, agentes terapéuticos o medicamentos pueden ser encapsulados y, así, protegidos de la degradación enzimática18. Liposomas que contienen N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20y21de dioctadecylamidoglycylspermine (perros), o DC-colesterol22, están bien caracterizadas y utilizado con frecuencia para transfección celular con ADN o ARN.
Liposomas catiónicos comprenden un lípido positivamente cargado y un fosfolípido23. Través de catiónicos liposomas de transfección es uno de los métodos más comunes para el transporte de los ácidos nucleicos en células24,25. Las partículas de lípidos catiónicos forman complejos con los grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico26. Estos supuestos lipoplexes fije a la superficie de la membrana celular y entrar en la célula mediante endocitosis o mecanismos de endocitosis como27.
En 1989, Malone et al. con éxito se describe catiónico mediada por lípidos mRNA transfección28. Sin embargo, usando una mezcla de DOTMA y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), el grupo encontró que DOTMA manifiesta efectos citotóxicos28. Además, Zohra et al demostró que DOTAP (cloruro de 1, 2-dioleoyloxy-3-trimetilamonio-propano) puede utilizarse como un mRNA de la transfección reactivos29. Sin embargo, para la transfección eficiente de células, DOTAP debe utilizarse en combinación con otros reactivos, tales como fibronectina29 o30de la droga. Hasta ahora, DOTMA era el lípido catiónico primero en el mercado para el gen entrega31. Otros lípidos son utilizados como portadores de la terapéuticos o se están probando en diferentes etapas de ensayos clínicos (p. ej., EndoTAG-I, que contiene DOTAP como portador lípido), actualmente está siendo investigada en un ensayo clínico de fase II32.
Este trabajo describe un protocolo para la generación de NLps que contiene colesterol DC y la droga. Este método es fácil de realizar y permite la generación de NLps de diferentes tamaños. El objetivo general de generación de PNL mediante el método de película seca es crear liposomas para la complejación de mRNA, así permitiendo la transfección eficiente y biocompatibles de la célula en vitro14,33.
El protocolo presentado describe la generación de NLps con eficacia alta encapsulación de mRNA sintético modificado, así como la fiable transfección de células en vitro. Por otra parte, las NLps garantiza la liberación de ARNm, que a su vez, se traduce en una proteína funcional dentro de las células. Además, las transfecciones con NLps puede realizarse en medio celular regular, dando por resultado alta viabilidades de la célula durante la transfección, y durar hasta tres días después de la transfec…
The authors have nothing to disclose.
Ninguno
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |