β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi
Summary
Burada sunulan tek tek veya birlikte fibrin pıhtısı yapısı üzerinde beta-amiloid etkisini analiz için kullanılan iki yöntem vardır. Vitro fibrin pıhtısı oluşturma takip için pıhtı bulanıklık ve Tarama elektron mikroskobu ile yöntemleri dahil bir protokoldür.
Abstract
Bu makale in vitro fibrin pıhtısı oluşturma ve beta-amiloid (Aβ) protein pıhtı oluşumu ve yapısı üzerinde etkisi spektrometresi tarafından analiz ve elektron mikroskobu (SEM) tarama yöntemleri sunar. Aβ nörotoksik amiloid toplamları Alzheimer hastalığı içinde (Ah) formları, fibrinojen ile etkileşim göstermiştir. Bu Aβ-fibrinojen etkileşim fibrin pıhtısı yapısal anormal ve fibrinolitik dayanıklı yapar. Fibrin pıhtılaşma bozuklukları Aβ kaynaklı Ayrıca serebrovasküler yönleri gibi microinfarcts, reklam patoloji ile katkıda inflamasyonu yanı sıra, serebral amiloid angiopathy (CAA). Nörovasküler açıkları potansiyel olarak kritik rolü AD patolojisi göz önüne alındığında, inhibe veya Aβ-fibrinojen etkileşimi azaltmak bileşikleri gelişmekte umut verici tedavi değeri vardır. Kolayca ve sistematik olarak tarafından hangi fibrin pıhtısı oluşumu tespit edilebilir vitro terapötik bileşiklerin geliştirmek için potansiyel olarak yararlı araçlar yöntemlerdir. Burada sunulan bir en iyi duruma getirilmiş Aβ ve Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri etkisini analiz yanı sıra fibrin pıhtısı vitro nesil için iletişim kuralıdır. Pıhtı bulanıklık tahlil hızlı, son derece tekrarlanabilir ve aynı anda birden çok koşul sınamak için Aβ-fibrinojen inhibitörleri çok sayıda tarama için izin kullanılabilir. Bu tarama hit bileşikleri yeteneklerini Aβ kaynaklı yapısal anormallikler SEM kullanarak fibrin pıhtısı mimarisinin iyileştirmek için daha fazla değerlendirilebilir Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları etkinliği burada TDI-2760, yakın zamanda belirlenen Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörü kullanarak gösterilmiştir.
Introduction
Alzheimer hastalığı (Ah), yaşlı hastalarda bilişsel gerileme önde gelen bir nörodejeneratif hastalık çoğunlukla anormal beta-amiloid (Aβ) ifade, toplama ve engelli izni nörotoksisite1‘, kaynaklanan kaynaklanmaktadır 2. Aβ toplamları ve reklam3arasında iyi karakterize derneğin rağmen altta yatan hastalık patoloji kesin mekanizmaları iyi anlaşılan4değildir. Aβ doğrudan6dolaşım sistemi bileşenleriyle etkileşimli çalışır gibi öneriyor kanıt artan nörovasküler açıkları ilerleme ve reklam5, şiddeti bir rol oynamaktadır. Aβ da reklam hastalar ve fare modelleri9,10,11Aβ yataklarında yerelleştirir fibrinojen7,8, yüksek-benzeşme etkileşim vardır. Ayrıca, Aβ-fibrinojen etkileşim anormal fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı, aynı zamanda direnç fibrinolitik9,12neden olmaktadır. Reklam, tedavisinde bir tedavi imkanı hafifletilmesi dolaşım açıkları Aβ ve fibrinojen13,14arasındaki etkileşimi engelleyerek. Biz, bu nedenle, birkaç küçük bileşikler yüksek aktarım tarama ve tıbbi Kimya yaklaşımlar13,14kullanarak Aβ-fibrinojen etkileşim inhibe tespit. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri etkinliğini test etmek için biz iki yöntem vitro fibrin pıhtısı oluşumu analizi için en iyi duruma getirilmiş: pıhtısı bulanıklık tahlil ve Tarama elektron mikroskobu (SEM)14.
Pıhtı bulanıklık tahlil fibrin pıhtısı oluşumu UV-görünür spektroskopi kullanarak izlemek için düz ileri ve hızlı bir yöntemdir. Fibrin pıhtısı formlar, ışık giderek dağınık ve çözüm bulanıklık artar. Diğer taraftan, Aβ olmadığı durumlarda, fibrin pıhtısı yapısı değişmiş ve karışım bulanıklık azalır (Şekil 1). İnhibitör bileşiklerin etkisi pıhtı bulanıklık Aβ kaynaklı anormallikler geri yüklemek için potansiyel için tespit edilebilir. Bulanıklık tahlil birden çok koşul hızlı analiz için izin verirken, pıhtı şekli ve yapısı üzerinde sınırlı bilgi sağlar. SEM, katı cisimlerin topografya elektron sonda tarafından kendiliğinden ortaya sağlar pıhtı15,16,17,18 3D Mimarlık ve nasıl bir değerlendirme analizi için Aβ varlığı ve / veya inhibitör bileşikler o yapısı9,14değiştirir. Her iki spektrometresi ve SEM çeşitli amaçlar için kullanılan klasik laboratuvar teknikleri vardır, mesela spectrophotometry amiloid toplama19,20izlenmesi için kullanılır. Benzer şekilde, SEM Ayrıca Parkinson ve tromboembolik inme hastalarında21,22,23Alzheimer, plazma oluşan fibrin pıhtısı analiz etmek için kullanılır. Burada sunulan protokolleri fibrin pıhtısı oluşumu tekrarlanabilir ve hızlı bir şekilde değerlendirmek için optimize edilmiştir.
Aşağıdaki iletişim kuralı bir vitro fibrin-pıhtı ile ve ezelî Aβ hazırlanması için yönergeler sağlar. Ayrıca fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı üzerinde Aβ etkisini analiz yöntemleri ayrıntıları. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibisyonu ölçmek için bu iki yöntem etkinliğini TDI-2760, küçük bir inhibitör bileşik14kullanarak gösterilmiştir. Bu yöntemler, ayrı ayrı ve birlikte, hızlı ve basit bir analiz vitro fibrin pıhtısı oluşumu için olanak sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntemleri fibrin pıhtısı oluşumu vitrodeğerlendirilmesi için tekrarlanabilir ve hızlı bir yol sağlar. Ayrıca, sistem sadeliği Aβ fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı nispeten düz ileri etkilemesi yorumu yapar. Bu laboratuar önceki yayında, bu deneyleri bileşikler Aβ-fibrinojen etkileşim13,14etkisizleştirmek yeteneklerini için test etmek için kullanılabilir gösterildi. Bu iki deneyleri kullanılarak, bir dizi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso ve Michael Foley Tri-Kurumsal Therapeutics Discovery Enstitüsü (TDI), New York Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri sentezi için ve onların değerli öneriler teşekkür. Yazarlar ayrıca Üyeler Strickland laboratuarının yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser NIH grant NS104386, Alzheimer ilaç keşif Vakfı ve Robertson terapötik Geliştirme Fonu tarafından H.A. için NIH NS50537, Tri-Kurumsal Therapeutics Discovery Enstitüsü, Alzheimer’ın uyuşturucu keşif Vakfı Hibe desteklenmiştir, Rudin Aile Vakfı ve John A. Herrmann S.S. için
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer’s disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer’s disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer’s disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer’s disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer’s disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer’s disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer’s disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson’s disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
