Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren
Summary
Hier ist ein Workflow für die Kultur und Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen unter Fluid Schubspannung präsentiert. Enthalten ist eine räumliche Anordnung für die gleichzeitig Gehäuse und Überwachung mehrerer Fluss Kammern in einer kontrollierten Umgebung und die Verwendung einer exogenen Referenz-RNA für die quantitative PCR.
Abstract
Wir beschreiben einen Workflow für die Analyse der Genexpression von Endothelzellen unterliegen einem stetigen Laminar-Flow mit mehreren Kammern überwachten Parallel-Platte Fluss. Endothelzellen bilden die innere zelluläre Auskleidung der Blutgefäße und die Reibungskraft des Blutflusses genannt Schubspannung chronisch ausgesetzt sind. Unter physiologischen Bedingungen, Endothelzellen Funktion in Anwesenheit von verschiedenen Schubspannung Bedingungen. So kann die Anwendung der Schubspannung in in-vitro- Modelle einen tieferen Einblick in Endothelzellen Antworten in Vivobieten. Die Parallel-Platte Strömungsraum zuvor von Lane Et Al. veröffentlicht 9 ist an Endothelzellen Genregulation in an- und Abwesenheit des stetigen (nicht pulsierender) Laminar-Flow zu studieren. Wichtige Anpassungen im Setup für laminare Strömung wie hier dargestellt sind eine große, engagierte Umgebung Haus gleichzeitige Fluss Schaltungen, die Überwachung der Fördermengen in Echtzeit, und die Aufnahme einer exogenen Referenz RNA für die Normalisierung der quantitative Echtzeit-PCR-Daten. Um mehrere Behandlungen/Bedingungen mit der Anwendung der Schubspannung zu beurteilen, werden mehrere Flow Schaltungen und Pumpen gleichzeitig innerhalb der gleichen beheizt und befeuchteten Inkubator verwendet. Die Durchflussmenge des jede Strömung Schaltung misst kontinuierlich in Echtzeit Schubspannung Bedingungen während der Experimente zu standardisieren. Da diese Experimente mehrere Bedingungen haben, verwenden wir auch eine exogene Referenz-RNA, die versetzt-in zur Zeit der RNA-Extraktion für die Normalisierung der RNA-Extraktion und erste Strang cDNA Synthese Effizienz ist. Diese Schritte minimieren die Variabilität zwischen den Proben. Diese Strategie ist in unserer Pipeline für die Gen-Expression-Analyse mit Schubspannung Experimente mit Parallel-Platte Strömungsraum eingesetzt, aber Teile dieser Strategie, wie die exogene RNA-Spike-in verweisen, können einfach und kostengünstig für verwendet werden andere Anwendungen.
Introduction
Vaskuläre endotheliale Zellen bilden das zelluläre Innenfutter der Blutgefäße im geschlossenen Kreislauf der höheren Arten. Sie bilden die Schnittstelle zwischen Blut und Gewebe und zeichnen sich durch luminalen und abluminalen Oberflächen. Das Endothel ist eine vielfältige, aktive und adaptive System, die Durchblutung, Nährstoff Menschenhandel, Immunität und das Wachstum neuer Blutgefäße Schiffe1reguliert. Im Körper gibt es endotheliale Zellen normalerweise in einem Umfeld, wo sie die Reibungskraft der Zirkulation, Schubspannung2ausgesetzt sind. Scherspannung ist ein wichtiger Regulator der Endothelzellen Gen Ausdruck3, und Endothelzellen versuchen weiterhin Schubspannung innerhalb eines gegebenen Bereichs2,4. Endothelzellen zeigen angiogenen Musterung in Ermangelung der Schubspannung5 , die Gewebedurchblutung verbessern können. Regionale Muster der gestörten Strömung und veränderten Schubspannung sind der Ausdruck der entzündlichen Gene6 und die Entwicklung von Atherosklerose7,8zugeordnet. So sind Modelle, die Scherspannung enthalten ein Hauptbestandteil der endothelialen Genregulation zu verstehen.
Wir beschreiben eine Methode zur Untersuchung der Genregulation im vaskulären endothelialen Zellen unter Scherbelastung. Dieses System nutzt nicht pulsierende Strömung und imitiert Fluid Schubspannung Ebenen und Sauerstoffkonzentration, Modell Bedingungen für arterielle Endothelzellen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Informationen zu Methoden für die Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi), die Einstellung für die Anwendung der Schubspannung mit dem Parallel-Platte Fluss Apparate und Methoden für das Spike-in einer exogenen Referenz RNA vor der Analyse von Gen-knockdown Reverse-Transkriptase quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Diese Pipeline dient zur Genregulation in Endothelzellen in an- und Abwesenheit von laminar Schubspannung zu studieren und beinhaltet eine Anpassung des Parallel-Platte Fluss Apparates von Lane Et Al. beschrieben 9. dieses bestimmten Set-up wurde entwickelt, um die gleichzeitige Bewertung von mehreren experimentellen Bedingungen zu ermöglichen, die Scherspannung Bedingungen im direkten Vergleich sowie die Normalisierung der RNA Analyse ermöglicht. Eine große beheizte Einheit mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit wird genutzt, um mehrere separate Strömung Kammern und Pumpen mit Flussraten für jede Kammer fließmontage in Echtzeit überwacht gleichzeitig ausgeführt werden können. Die Anwendung dieses Set-up ist für gen-Knockdown mit RNAi in der Umgebung von Laminar-Flow/Scherbeanspruchung verwendet, sondern Aspekte dieses Protokolls auf die Beurteilung der RNA Ausdruck angewendet werden können.
Gemeinsame Konzepte für die Anwendung der Schubspannung für Endothelzellen gehören mikrofluidischen Systemen10, ein Kegel-Platte-Viskosimeter11und eine Parallel-Platte Fluss Kammer12. Mikrofluidischen Systemen verschiedener Hersteller wurden nützlich beim Studium von Mechanobiology und mechanotransduktion in mehrere Zell- und Gewebetypen und eine Vielzahl von biophysikalischen reizen. Für Endothelzellen wurden sie zur Endothelzellen in Isolierung sowie das Zusammenspiel von Endothelzellen und des Menschenhandels immun oder Tumor Zellen10zu studieren. Diese Systeme eignen sich jedoch weniger für die Wiederherstellung einer großen Zahl von Zellen9. Die Kegel-Platte-Viskosimeter und Parallel-Platte Fluss Kammern ermöglichen die Wiederherstellung einer großen Anzahl von Zellen in konfluierende Monolagen12. Diese Systeme können eine Reihe von scher Kräfte und Muster12erzeugen. Die Parallel-Platte Fluss Kammer Versammlung9 hat den Vorteil, dass Echtzeit-Bildgebung durch die Glasscheibe auszuwertende zellulären Morphologie zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann die Perfusat unter sterilen Bedingungen gesammelt werden. Für das hier vorgestellte System kann die Strömung auch überwacht werden, in Echtzeit und in ein Mehrkammer-Setup, das erleichtert die Wartung der Scherung Bedingungen zwischen den Kammern.
Für repräsentative Experimente dienen der menschlichen nabelader Endothelzellen (HUVECS), die eine vaskuläre Endothelzellen Art darstellen, und die Schubspannung Bedingungen, die wir verwenden (1 Pa) arterielle Bedingungen zu reflektieren (0,1 – 0,7 Pa). Jedoch dieses Protokolls kann andere Endothelzellen verwendet werden, und die Schubspannung Bedingungen eingestellt werden, nach experimentellen Frage. Beispielsweise die Bewertung der menschlichen Endothelzellen unter Bedingungen, die venösen Kreislauf Modell müssten geringere Scherbeanspruchung (1-6 Pa) und Studien, die mikrovaskuläre Zirkulation Modell verwendet haben Schubspannung Ebenen von 0,4 – 1,2 Pa13 , 14. Darüber hinaus Scherspannung kann sogar zwischen endothelial Zellen innerhalb der gleichen Blutgefäß6variieren. In der aktuellen Konstellation wird ein einzelnes monitoring-System verwendet, das kann vier separate Strömung Schleifen gleichzeitig überwachen. Für Labors, die mehr Strömung Schleifen benötigen, gibt es Raum in den dedizierten Umgebung für eine zusätzliche monitoring-System.
RT-qPCR dient die absolute Quantifizierung der Genexpression in der Einstellung der Schubspannung. Der relativen Ausdruck Zielgene dient oft RNA Ausdruck über Bedingungen zu vergleichen. Einige RNA-Spezies können bei sehr geringen Mengen vorhanden sind oder fehlen, so komplizieren relative Messungen. Zum Beispiel können lange Forensisches RNAs in Endothelzellen potente Effekte bei relativ geringen Kopienzahl pro Zelle5ausüben. Darüber hinaus können Unterschiede in der Effizienz der Grundierung zu eine ungenaue Interpretation führen von der Verwendung der Delta-Delta Zyklus Schwelle (Ct) Methode zum Analysieren der Daten. Um dieses Problem zu beheben, führen wir absolute Quantifizierung durch die Erzeugung einer Standardkurve mit einer bekannten Menge von Plasmid DNA. Darüber hinaus ergänzende DNA (cDNA)-Synthese ist ein ineffizienter Prozess, und Unterschiede in der Effizienz der cDNA können Unterschiede in RNA Ausdruck zwischen Bedingungen und Proben15entfallen. Die Anwendung der Schubspannung und/oder Transfektion Reagenzien kann beeinflussen, Zellproliferation, Apoptose und Lebensfähigkeit oder Hinzufügen von Komponenten, die RNA-Isolierung und/oder cDNA Synthese stören können. Um die Möglichkeit der Voreingenommenheit von RNA Isolation und cDNA Synthese berücksichtigen, verwenden wir ein Spike RNA Eingabesteuerelement im Labor synthetisiert, zum Zeitpunkt der RNA-Extraktion hinzugefügt und mit jeder cDNA Synthese über RT-qPCR gemessen. Dies ermöglicht nicht nur die Anpassung technische Unterschiede in RNA-Extraktion und cDNA Synthese, sondern ermöglicht auch die Berechnung der absoluten Mengen pro Zelle, wenn die Zellzahl bekannt ist.
Dieses System nutzt zusätzliche Schritte zur Aufrechterhaltung der Ähnlichkeit oder technische Unterschiede zwischen Bedingungen entfallen. Wir betonen vor allem diese Schritte aufgrund der Komplexität dieser Experimente, die beinhalten mehrere physische Set-ups und experimentellen Bedingungen, die experimentelle Variabilität führen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Scherspannung ist eine physiologische Bedingung, die endotheliale Funktion teilweise moduliert durch Einwirkung auf stationären Gen Ausdruck2,5. Modelle der Genregulation in verschiedenen Schubspannung Bedingungen tragen zu einem besseren Verständnis der Endothelfunktion. Diese pragmatische Workflow umfasst eine Fluss-Schaltung mit einem Parallel-Platte Strömungsraum adaptiert von Lane Et al. 9 und stellt laminar, nicht pulsier…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch CIHR MOP 142307, P.A.M. H.S.J.M. ist ein Empfänger einer kanadischen Institute der Gesundheit Forschung Ausbildung in der regenerativen Medizin Gemeinschaft. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. und M.K.D. sind Empfänger von Königin Elizabeth II Graduate Stipendien in der Wissenschaft und Technik.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
Referências
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