Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers
Summary
Qui, un flusso di lavoro per l’analisi di espressione di cultura e gene delle cellule endoteliali sotto sollecitazione di taglio fluido è presentato. È inclusa una disposizione fisica per alloggiamento e monitoraggio più alloggiamenti di flusso in un ambiente controllato e l’uso di un RNA di riferimento esogeno per PCR quantitativa contemporaneamente.
Abstract
Descriviamo un flusso di lavoro per l’analisi dell’espressione genica da cellule endoteliali soggette a un costante utilizzando più monitorato parallelo-piastra flusso camere a flusso laminare. Le cellule endoteliali formano il rivestimento cellulare interno dei vasi sanguigni e sono cronicamente esposti alla forza di attrito del flusso sanguigno chiamato shear stress. In condizioni fisiologiche, funzione delle cellule endoteliali in presenza di diverse condizioni di sollecitazione di taglio. Così, l’applicazione delle condizioni di sollecitazione di taglio in modelli in vitro può fornire una maggiore visibilità sulle risposte endoteliali in vivo. La camera di flusso parallelo-piastra precedentemente pubblicata da Lane et al. 9 è adattato per studiare la regolazione genica endoteliale in presenza ed assenza di flusso laminare (non pulsante) costante. Chiavi adattamenti in allestimento per flusso laminare come presentato qui includono un ambiente grande, dedicato ai circuiti di flusso simultaneo di casa, il monitoraggio delle portate in tempo reale e l’inclusione di un riferimento esogeno RNA per la normalizzazione della dati quantitativi di PCR in tempo reale. Per valutare più trattamenti/condizioni con l’applicazione della sollecitazione di taglio, più circuiti di flusso e pompe sono utilizzate contemporaneamente all’interno dell’incubatore stesso riscaldata e umidificata. La portata di ogni circuito di flusso è misurata continuamente in tempo reale per standardizzare le condizioni di sollecitazione di taglio in tutto gli esperimenti. Perché questi esperimenti hanno più condizioni, usiamo anche un RNA di riferimento esogeno è a spillo-al momento dell’estrazione del RNA per la normalizzazione di estrazione del RNA e l’efficienza di sintesi del cDNA del primo-filo. Questi passaggi di ridurre al minimo la variabilità tra i campioni. Questa strategia è impiegata nella nostra pipeline per l’analisi di espressione genica con esperimenti di sollecitazione di taglio utilizzando la camera di flusso parallelo-piastra, ma parti di questa strategia, come ad esempio l’esogeno fa riferimento spike-nel RNA, può facilmente e in modo conveniente essere usati per altre applicazioni.
Introduction
Le cellule endoteliali vascolari formano il rivestimento cellulare interno dei vasi sanguigni nel sistema cardiovascolare chiuso delle specie superiori. Essi formano l’interfaccia tra sangue e tessuti e sono caratterizzati da luminal e superfici abluminale. L’endotelio è un sistema diversificato, attivo e adattivo che regola il flusso sanguigno, traffico di sostanze nutritive, l’immunità e la crescita di nuovi vasi sanguigni1. Nel corpo, le cellule endoteliali presenti normalmente in un ambiente dove sono esposti per la forza di attrito della circolazione, sollecitazione di taglio2. Sollecitazione di taglio è un regolatore importante di cellule endoteliali gene expression3e cellule endoteliali tentano di mantenere la sollecitazione di taglio all’interno di un determinato intervallo2,4. Cellule endoteliali dimostrano angiogenici patterning in assenza di sollecitazione di taglio5 che possono migliorare la perfusione tissutale. Modelli regionali di flusso disturbato e alterato shear stress sono associati con l’espressione di geni infiammatori6 e lo sviluppo di aterosclerosi7,8. Così, modelli che includono la sollecitazione di taglio sono una componente importante di comprensione regolazione genica endoteliale.
Descriviamo un metodo per lo studio della regolazione genica in cellule endoteliali vascolari sotto sollecitazione di taglio. Questo sistema utilizza flusso non pulsante e imita i livelli di fluido shear stress e concentrazione di ossigeno che condizioni di modello per cellule endoteliali arteriose. Questo protocollo include dettagli dei metodi per l’atterramento di gene usando RNA interference (RNAi), il set-up per l’applicazione della sollecitazione di taglio utilizzando l’apparato di flusso parallelo-piastra e metodi per lo spike-in di un riferimento esogeno RNA prima dell’analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR). Questa pipeline viene utilizzata per lo studio della regolazione genica in cellule endoteliali in presenza ed assenza di sollecitazione di taglio laminare e include un adattamento dell’apparato parallelo-piastra flusso descritto da Lane et al. 9. questo particolare set-up è stato progettato per facilitare la valutazione simultanea di più condizioni sperimentali che permette un confronto diretto delle condizioni di sollecitazione di taglio, così come la normalizzazione dell’analisi di RNA. Una grande unità riscaldata con umidità controllata viene utilizzata per consentire più flusso separato e le pompe in esecuzione contemporaneamente con portate monitorate per ogni assembly di camera di flusso in tempo reale. Viene utilizzata l’applicazione di questo set-up per atterramento di gene usando RNAi nella regolazione del flusso laminare/shear stress, ma gli aspetti di questo protocollo possono essere applicati a qualsiasi valutazione di espressione di RNA.
Approcci comuni per l’applicazione della sollecitazione di taglio per le cellule endoteliali sono di sistemi microfluidici10, un viscosimetro cono e piastra11e un flusso parallelo-piastra camera12. Sistemi microfluidici da vari produttori sono state utili nello studio mechanobiology e mechanotransduction in cella multipli e tipi di tessuto e una varietà di stimoli biofisici. Per le cellule endoteliali, essi sono stati utilizzati per studiare le cellule endoteliali in isolamento, come pure l’interazione delle cellule endoteliali e la tratta di cellule immunitarie o tumore10. Tuttavia, questi sistemi sono meno adatti per il recupero di un gran numero di cellule9. Camere a flusso parallelo-piastra sia il viscosimetro cono e piastra permettono il recupero di un gran numero di cellule in monostrati confluenti12. Questi sistemi possono generare una gamma di modelli e forze di taglio12. Il flusso parallelo-piastra camera Assemblea9 ha il vantaggio che la formazione immagine in tempo reale possono essere eseguite tramite la finestra di vetro per valutare la morfologia cellulare in qualsiasi momento. Inoltre, il perfusato possa essere raccolti in condizioni sterili. Per il sistema presentato qui, il flusso può anche essere monitorato in tempo reale e in un set-up del multi-alloggiamento, che facilita il mantenimento di condizioni di taglio tra le camere.
Per esperimenti di rappresentanza, cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC), che rappresentano un tipo di cellula endoteliale macrovascular, sono utilizzate, e le condizioni di sollecitazione di taglio usiamo (1 Pa) riflettono condizioni arteriose (0.1 – 0.7 Pa). Tuttavia, questo protocollo può essere usato con altri tipi di cellule endoteliali e le condizioni di sollecitazione di taglio possono essere regolate secondo la questione sperimentale. Ad esempio, la valutazione delle cellule endoteliali umane in condizioni che modellano la circolazione venosa richiederebbe più bassi livelli di sollecitazione di taglio (1-6 Pa) e studi che modellano la circolazione microvascolare hanno utilizzato i livelli di sollecitazione di taglio di 0.4 – 1.2 Pa13 , 14. Inoltre, la sollecitazione di taglio può variare anche tra cellule endoteliali all’interno del vaso sanguigno stesso6. Nell’attuale assetto, viene utilizzato un singolo sistema di monitoraggio che possono monitorare contemporaneamente quattro anelli di flusso separato. Per i laboratori che hanno bisogno di più cicli di flusso, c’è spazio nell’ambiente dedicato per un sistema di monitoraggio aggiuntivo.
RT-qPCR viene utilizzata per la quantificazione assoluta di espressione genica nella cornice della sollecitazione di taglio. L’espressione relativa dei geni target viene spesso utilizzato per confrontare l’espressione del RNA in condizioni. Alcune specie di RNA può trovarsi in quantità molto basse o essere assente, complicando così misure relative. Ad esempio, lungo non codificanti RNA nelle cellule endoteliali possa esercitare effetti potenti a numeri di copia relativamente basso per ogni cella5. Inoltre, le differenze di rendimento primer possono portare a un’interpretazione inesatta da utilizzando il metodo di delta-delta ciclo soglia (Ct) per analizzare i dati. Per risolvere questo problema, eseguiamo la quantificazione assoluta generando una curva standard usando una quantità nota di DNA plasmidico. Inoltre, complementari sintesi di DNA (cDNA) sono un processo inefficiente, e le differenze di rendimento di cDNA possono tenere conto delle differenze nell’espressione di RNA tra condizioni e tra campioni15. L’applicazione della sollecitazione di taglio e/o reagenti di transfezione può influenzare la vitalità, apoptosi e proliferazione delle cellule, o aggiungere componenti che potrebbero interferire con la sintesi di RNA isolamento e/o cDNA. Per tenere conto la possibilità di polarizzazione da isolamento del RNA e la sintesi di cDNA, usiamo un spike-in RNA controllo sintetizzato in laboratorio, aggiunto al momento dell’estrazione del RNA e misurato con ogni cDNA sintesi tramite RT-qPCR. Questo consente non solo l’adeguamento tecnico differenze nella sintesi di estrazione e cDNA RNA ma consente anche il calcolo delle quantità assolute per cella, quando è noto il numero di celle.
Questo sistema utilizza ulteriori passaggi per mantenere similitudini o tenere conto delle differenze tecniche tra le condizioni. In particolare sottolineiamo questi passi a causa della natura complessa di questi esperimenti, che coinvolgono molteplici configurazioni fisiche e condizioni sperimentali che possono condurre alla variabilità sperimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sollecitazione di taglio è una condizione fisiologica che modula la funzione endoteliale, in parte, colpendo allo steady-state gene expression2,5. Modelli di regolazione genica in diverse condizioni di sollecitazione di taglio contribuirà ad una maggiore comprensione della funzione endoteliale. Questo flusso di lavoro pragmatico include un circuito di flusso utilizzando una camera di flusso parallelo-piastra adattata da Lane et al. 9<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da CIHR MOP 142307 a P.A.M. H.S.J.M. è un destinatario di un canadese istituti di salute ricerca formazione programma in compagnia di medicina rigenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. e M.K.D. sono destinatari delle Queen Elizabeth II laurea Borse di studio nella scienza e nella tecnologia.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
Referências
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