Démêlé les acteurs clés de l’immunité humorale : avancé et optimisé protocole d’isolement de Lymphocyte de patchs murin de Peyer
Summary
Dans cette étude, nous présentons un roman et un protocole efficace pour isoler des lymphocytes de plaques de Peyer (PPs), qui peuvent être utilisés ultérieurement pour des essais fonctionnels in vivo et in vitro , mais aussi des études cytométrie en flux de T folliculaire d’assistance et des cellules germinales Centre B.
Abstract
Dans la muqueuse de l’intestin, cellules immunitaires constituent une entité unique immunologique, ce qui favorise la tolérance immunitaire tout en conférant simultanément des défenses immunitaires contre les agents pathogènes. Il est bien établi que de Peyer (PPs) ont un rôle essentiel dans le réseau de système immunitaire muqueux en accueillant plusieurs effecteur T et cellules B sous-ensembles. Une certaine fraction de ces cellules effectrices, les folliculaire T helper (TFH) et les cellules de B de centre germinatif (GC) sont professionnalisé dans la régulation de l’immunité humorale. Par conséquent, la caractérisation de ces sous-ensembles de cellules au sein du PPs quant à leur programme de différenciation et les propriétés fonctionnelles peut fournir des informations importantes concernant l’immunité des muqueuses. À cette fin, une méthode facilement applicable, efficace et reproductible d’isolement de lymphocyte de PPs serait utile aux chercheurs. Dans cette étude, nous avons cherché pour générer une méthode efficace pour isoler des lymphocytes de souris PPs avec rendement élevé cellulaire. Notre approche a révélé qu’évoluées telles que l’utilisation de réactifs digestifs et agitation de tissu, le tissu initial ainsi que cell coloration de conditions et de sélection des panneaux d’anticorps, ont une grande influence sur la qualité et l’identité des lymphocytes isolés et sur résultats expérimentaux.
Nous décrivons ici un protocole permettant aux chercheurs d’isoler efficacement les populations de lymphocytes de PPs permettant l’évaluation reproductible écoulement cytometry des sous-ensembles de T et les lymphocytes B se concentrant principalement sur des sous-ensembles de cellules TFH et GC B.
Introduction
Le tube digestif entier dès le début à la fin est paré avec un vaste réseau lymphoïde qui contient des cellules immunitaires plus que tout autre organe chez l’homme et la souris1. Peyer de patchs (PPs) constituent une composante majeure de la branche intestinale de cet organisme immunitaire cellulaire, ce qu’on appelle tissu lymphoïde associé au tube digestif (GALT)2,3. Au sein de PPs, des milliers de millions d’antigènes provenant des matières alimentaires, agents pathogènes et le microbiote commensal sont échantillonnés en permanence et quand nécessaire les réponses immunitaires appropriées à leur égard sont monté immunitaire intestinal donc maintenant homéostasie. En ce sens, PPs peuvent être nommés comme « les amygdales de l’intestin grêle ». PPs sont constitués de grands compartiments secondaires : dôme sous-épithéliaux (SED), grandes zones de follicule de B-cellule ; l’épithélium de follicule associée sus-jacente (EAF) et interfolliculaire région (aux instruments IFR) où les cellules T sont situé au4. Ce cloisonnement unique des sous-ensembles de cellules effectrices différents PPs permet de coopérer, confère ainsi, immunocompétence dans le tube digestif.
PPs manquent de vaisseaux lymphatiques afférents, et pour cette raison, antigènes transportés à PPs d’intestin grêle ne sont pas en cours par l’intermédiaire des vaisseaux lymphatiques contrairement à la plupart des autres organes lymphoïdes. Au lieu de cela, les cellules épithéliales spécialisées situés dans EAF, appelées cellules M, sont responsables pour le transfert des antigènes luminaux dans le PPs5. Par la suite, les antigènes transportés sont captés par les cellules dendritiques (CD) et les phagocytes qui sont trouvent dans la région de dôme sous-épithéliaux (SED) sous les EAF6,7. Ce processus de tri antigène par DCs dans le PP est crucial pour initier la réponse immunitaire adaptative8 et la génération ultérieure d’IgA sécréteur cellules9.
En raison du lourd fardeau antigénique de la flore commensale et matériel alimentaire, PPs hôte endogène activé effecteur T et cellules B sous-ensembles en grande abondance par exemple TFH et IgA+ GC B cellules10, suggérant que le PPs représentent un site d’immunitaire active réponse11. Détection jusqu’à 20-25 % cellules CD4 total FOH+ T cell compartiment et jusqu’à 10 à 15 % GC B cellules au sein des cellules B totales est possible en PPA prélevés non immunisés de souris C57BL/6 jeunes12. Contrairement à d’autres types de cellule auxiliaire T (i.e., Th1, Th2, cellules Th17), TFH cellules présentent tropisme unique follicule lymphocytes B, principalement en raison de l’expression CXCR5, qui promeut le homing cellule TFH le long du gradient CXCL1313. Dans les zones de follicule de lymphocytes B du PPs, cellules TFH induisent la recombinaison de commutateur de classe IgA et le hypermutation somatique dans les lymphocytes B activés d’où haute affinité IgA produisant des cellules différencient le14. Par la suite, ces plasmocytes sécrétant des anticorps migrent vers la lamina propria (LP) et réguler l’homéostasie immunitaire dans le tube digestif10.
Identification et caractérisation des populations de cellules TFH et GC B dans PPs pourraient permettre aux chercheurs étudier la dynamique de la réponse immunitaire humorale dans des conditions d’équilibre sans avoir besoin de modèles de vaccination chronophage utilisé traditionnellement en TFH-GC B cellule études15,16,17,18. Analysant les cellules TFH dans PPs n’est pas aussi simple que les autres sous-ensembles de cellules. Défis techniques comprennent l’identification des conditions de préparation de tissu idéal, combinaison anticorps-marqueur de surface, mais aussi de sélectionner des contrôles positifs et négatifs appropriés. Champs de recherche tant TFH et PP pièce grande variabilité en termes de procédures expérimentales et sont loin de conférer un consensus afin d’établir des protocoles standardisés pour différentes raisons. Tout d’abord, chaque sous-ensemble de cellules au sein du PPs tend à être affectées différemment par les conditions de préparation des tissus nécessitant des modifications supplémentaires dans une manière de sous-ensemble spécifique de cellule. Deuxièmement, il y a un écart important entre les méthodes signalées concernant les détails de la préparation de cellules de PPS. Troisièmement, le nombre d’études comparatives basées sur le protocole étudie les techniques de préparation des tissus idéal et conditions expérimentales pour PP et TFH recherche est plutôt limité.
Les études actuelles basées sur le protocole suggérés pour PP cellule préparation19,20,21,22 n’étaient pas TFH – ou GC axée sur les lymphocytes B. En outre, certaines conditions de préparation de tissus recommandées pour PPs19,20 comme la digestion de collagénase base trouvées d’affecter le résultat de l’identification de TFH par cytométrie18. Sur cette base, nous avons pensé qu’un protocole optimisé, standardisé et reproductible qui peut être utilisé pour étudier la dynamique de cellules TFH et GC B dans PPs pourrait se révéler utile aux enquêteurs travaillant sur le sujet. Ce besoin nous a donné l’élan nécessaire pour générer un protocole amélioré et à jour pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes PP finement optimisée pour la récupération de cellulaire, la viabilité et l’efficacité pour la caractérisation de cytométrie en flux de plusieurs T et B sous-ensembles de cellules. Nous visait également à exclure plusieurs étapes de préparation laborieuse suggérés dans les protocoles antérieurs, ainsi, réduire les manipulations nécessaires et le temps de préparation de tissus et de cellules de PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la caractérisation de cytométrie en flux des cellules TFH et GC B. Un des principaux avantages de notre protocole est qu’il permet l’isolement de jusqu’à 10 cellules PP totales7 (en moyenne 4 à 5 x 106 cellules) d’une seule souris (souche C57BL/6) sans n’importe quel processus de digestion. Nous avons observé que le rendement total de cellules est positivement corrélé avec le nombre de PPs et pouvait être estimé à partir de l’équat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Laura Strauss et Peter Sage pour discussions utiles et appuyer avec les analyses de cytométrie de flux.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
Referências
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