체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

Summary

이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.

Abstract

창 자 점 막에 면역 세포 병원 균에 대 한 면역 방어를 동시에 부여 하는 동안 면역 관용을 승진 시키는 독특한 면역 엔티티를 구성 합니다. 잘 설립 Peyer의 패치 (조달 청) 여러 이펙터 T와 B 세포의 하위 집합을 개최 하 여 점 막 면역 네트워크에 필수적인 역할을 했습니다. 이러한 이펙터 셀, follicular T 도우미 (TFH) 및 본 원 센터 (GC) B 세포의 특정 분수는 독립적일 체액 성 면역의 규칙에서. 따라서, 그들의 차별화 프로그램 및 기능 속성을 조달 청에 내에서 이러한 셀 하위 특성 점 막 면역에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 위해 조달 청에서 림프 구 분리는 쉽게 적용, 효율적이 고 재현 방법 연구에 귀중 한 것입니다. 이 연구에서 우리가 높은 셀 수익률 마우스 조달 청에서 세포를 분리 하는 효과적인 방법 생성 목적입니다. 우리의 접근 공개 소화 시 약 및 조직 동요의 사용과 같은 처리 하는 초기 조직으로 세포 얼룩 조건 및 항 체 패널의 선택, 품질 및 고립 된 림프 톨의 정체성에 큰 영향력을가지고 실험 한 결과

여기, 우리가 효율적으로 재현 흐름 cytometry 기반 평가 TFH와 GC B 세포 하위 집합에 초점을 주로 하는 T와 B 세포 하위 집합을 허용 하는 조달 청에서 림프 구 인구를 분리 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

Introduction

끝에 처음부터 전체 위 장관 이상 어떤 다른 인간의 기관 및 마우스¹면역 세포를 포함 하는 광범위 한 림프 네트워크와 갑판입니다. 파이어의 패치 (조달 청)이 세포 면역 조직, 소위 창 자 연관 된 림프 조직 (GALT)^2,3장 분기의 주요 구성 요소를 구성. 조달 청, 항 원 식이 자료에서 파생 된의 수백만의 수천에서 공생 microbiota 및 병원 체, 샘플링 되 고 그들을 향해 필요한 적절 한 면역 반응 탑재 따라서 유지 장 면역 항상성입니다. 그런 의미에서 조달 청 “편도 소장”으로 라는 수 있습니다. 조달 청 주요 하위 구획의 구성: subepithelial은 돔 (SED) 큰 B-세포 뿌리 영역; overlying 뿌리 관련 상피 (FAE) 및 interfollicular 지역 (IFR) T 세포는 위치⁴. 따라서, 조달 청 협조, 가능 하 게 다른 이펙터 셀 하위 집합의이 독특한 서 용기에서 immunocompetence를 수 여.

조달 청 부족 입성 lymphatics, 그리고 이런이 이유로 인해 항 소장에서 조달 청에 이송 하지 실시 되 고 다른 림프 기관의 대부분과 달리 림프 혈관을 통해. 대신, FAE, 소위 M 세포에에서 위치한 전문된 상피 세포는 luminal 항 조달 청⁵에 전송 합니다. 그 후, 수송된 항 원에 의해 선택 모 수석 세포 (DCs) 및 FAE^6,7아래 subepithelial 돔 (SED) 지역에 있는 식 세포. Dc는 PP에이 항 원 정렬 과정은 적합 한 면역 반응⁸ 및 IgA 은닉 세포⁹의 후속 세대를 시작 중요 합니다.

공생 식물과 식이 자료 항 원 부담 때문 PPs 호스트 endogenously 활성화 이펙터 T TFH 그리고이⁺ 가 GC B 세포¹⁰, 같은 훌륭한 나타났는데 하위 집합 B 세포 조달 청 활성 면역의 사이트 대표 제안 응답¹¹. 최대 20-25%의 총 CD4 내의 TFH 셀⁺ T 세포 구획 및 최대 10-15% 총 B 세포 내에서 GC B 세포 이다 unimmunized 젊은 C57BL/6 마우스¹²에서 수집 하는 조달 청에서 가능 하다. 달리 다른 T 조 수 세포 유형 (즉., Th1, Th2, Th17 세포), TFH 셀 CXCL13 그라데이션¹³따라 TFH 셀 유도 승진 시키는 CXCR5 식 때문에 주로 B 세포 모 낭에 독특한 차 있는 굴곡 운동 표시. 조달 청의 B 세포 뿌리 영역에서 TFH 셀이 종류 스위치 재결합 및 활성화 된 B 세포에서 높은 선호도 생산 하는가 세포 분화¹⁴에 신체적인 hypermutation 유도. 그 후, 이러한 항 체 은닉 플라스마 세포 lamina propria (LP)에 이주 하 고 용기¹⁰면역 항상성 조절.

식별 및 조달 청 내 TFH와 GC B 세포 인구의 체액 면역 반응 시간이 걸리는 면역 모델의 필요 없이 정상 상태 조건 하에서 역학 조사 연구원 사용 수 있습니다. 전통적으로 TFH GC B 세포 연구^15,,1617,18에 사용. 조달 청 내의 TFH 셀 분석 다른 셀의 하위 집합으로 간단 하지 않습니다. 기술 과제 포함 식별 이상적인 조직 준비 상태, 표면 항 체-마커 조합으로 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 선택 합니다. TFH 그리고 PP 연구 분야 실험 절차의 측면에서 큰 다양성을 전시 하 고 부여 하는 여러 가지 이유로 인해 표준화 된 프로토콜을 설정 하는 합의. 첫째, 조달 청 내 각 세포 부분 집합 차동 조직 준비 조건 추가 셀 집합 특정 방식으로 수정 요구에 의해 영향을 받을 경향이 있다. 둘째, 조달 세 번째, 이상적인 조직 준비 기술 및 실험 조건 조사 프로토콜 기반 비교 연구의 수에서 셀 준비의 세부 사항에 관한 보고 방법 중에서 중요 한 차이가 있다 PP와 TFH 연구 다소 제한 됩니다.

현재 프로토콜 기반 연구 PP 셀 준비^19,20,21,22 에 대 한 제안 TFH-또는 GC B 세포 지향 되지 않았습니다. 또한, 콜라 기반 소화 등 조달 청^19,20 대 한 권장 일부 조직 준비 조건 cytometry에 의해 TFH 식별의 결과 부정적인 영향을 발견 했다¹⁸. 이 기초에, 우리는 최적화 된, 표준화 되 고 재현 가능한 프로토콜 TFH 조달 청 내에서 GC B 세포 역학을 공부 하는 데 사용할 수 있는이 주제에 수 사관을 가치가 있을 것 이라고 권유. 이 필요는 우리에 게 격리 및 정밀 하 게 세포 복구, 생존, 그리고 여러 T와 B의 흐름 cytometric 특성에 대 한 효율을 위해 최적화 된 PP 세포의 특성에 대 한 향상 및 최신 프로토콜을 생성 하는 원동력 셀의 하위 집합입니다. 우리는 또한 이전 프로토콜에 따라서, 제안 하는 여러 힘 드는 준비 단계를 제외 하 필요한 조작 및 조달 청에서 조직 및 세포 준비를 위한 시간을 줄이는 목적입니다.

Protocol

모든 연구 및이 프로토콜에서 설명 하는 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 베스 이스라엘 여자 집사 의료 센터의 지침에 따라 실시 했다. 1. 설계 실험 설정 및 마우스 그룹 (선택 사항) 공동 실험 쥐 실험 쥐 사이의 본질적인 microbiota의 수평 전송을 촉진 하 고 PP 세포 내에서 일반적인 다양성을 줄이기 위해 집. 또한, 같은 성별의 littermate 컨트롤을 사용 하 여 변…

Representative Results

이전 프로토콜20, 달리 우리 조달 청 시에 걸쳐 균등 하 게 배포 되지 않은 그러나 더 조밀 하 게 SI의 원심 및 인접 하는 끝을 향해 지역화와 같이 관찰 그림 1A. 흐름 cytometric 분석, 정확 하 게 따라 하는 경우 우리의 프로토콜 PP 림프 구 인구는 앞으로 사이드 분산형 배포 splenocytes (그림 2A</str…

Discussion

여기, 우리가 TFH와 GC B 세포의 흐름 cytometric 특성에 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점 중의 하나 이다는 하나의 마우스 (C57BL/6 변형)에서 최대 10⁷ (평균 4-5 x 10⁶ 셀) 총 PP 셀의 모든 소화 과정 없이. 총 셀 생산량 조달 청의 수와 긍정적으로 상관 했다 및 실험 계획에 대 한 도움이 되는 다음과 같은 간단한 방정식에서 예상할 수 있는 관찰: “총 PP 셀 수 ?…

Materials

anti-mouse CD4 antibody	eBioscience, Biolegend*	17-0041-81 ,10054*	For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibody	eBioscience	MA5-16536	For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibody	eBioscience	61-9985-82	For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibody	eBioscience	12-9942-82	For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibody	Biolegend	144610	For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibody	Biolegend*, BD Bioscience	145512*, 551960	For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibody	Biolegend	358512	For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibody	eBioscience	17-5773-82	For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421	BD Bioscience	563259	For detailed information see Table 1
FixableViability Dye	eBioscience	L34957	For detailed information see Table 1
7AAD	Biolegend	420404	For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32)	BD Bioscience	553141	For detailed information see Table 1
Collagenase II	Worthington	LS004176
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	eBioscience	00-5523-00
6-well,12-well & 96-well plates	Falcon/Corning	353046,353043/3596
50 ml conical tubes	Falcon	3520
40 µm cell strainer	Falcon	352340
10 ml syringe-plunger	Exel INT	26265
RPMI	Corning	15-040-CV
PBS	Corning	21-040-CM
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
Orbital shaker	VWR	Model 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor