Summary
Questo protocollo fornisce i passaggi necessari per stabilire e valutare il sepsis neonatale in 7 giorno-vecchi topi.
Abstract
Sepsis neonatale rimane un onere globale. È necessario un modello preclinico di interventi profilattici o terapeutici efficaci dello schermo. La sepsi polimicrobica neonatale del mouse può essere indotta iniettando cecal liquami intraperitonealmente nel giorno della vita 7 topi e loro monitoraggio per la settimana seguente. La procedura dettagliata necessaria per l'attuazione di questo modello di sepsi neonatale sono presentati qui. Questo include fare uno stock di liquame cecal omogeneo, diluirla per una dose di lettiera-regolato e di peso, una struttura del programma di monitoraggio e una definizione delle categorie di salute osservati utilizzato per definire gli endpoint humane. La generazione di uno stock di liquame cecal omogeneo da donatori pool permette l'amministrazione in molte cucciolate nel tempo, riducendo la variazione tra i donatori ed impedendo l'utilizzo di glicerolo potenzialmente tossico. La strategia di monitoraggio utilizzata consente l'anticipazione del risultato di sopravvivenza e l'identificazione dei topi che più tardi sarebbe progresso alla morte, consentendo un'identificazione precoce dell'endpoint humane. Due principali caratteristiche comportamentali vengono utilizzati per definire i punteggi di salute, vale a dire, la capacità dei topi neonatale a destra se stessi quando sono immessi sulla loro schiena e loro livello di mobilità. Questi criteri potenzialmente potrebbero essere applicati per indirizzare gli endpoint humane in altri studi della malattia neonatale nei topi, come uno studio pilota è effettuato per confermare la precisione. In conclusione, questo approccio fornisce un metodo standardizzato per il sepsis neonato modello nei topi, fornendo risorse per valutare il benessere degli animali utilizzati per definire endpoint precoce umano per animali sfidati.
Introduction
La sepsi è delle principali cause di decessi infettiva neonato umano1. Perché neonato sepsi sono capita male, scarsi progressi compiuti in entrambi l'identificazione dei neonati a rischio presto durante la malattia e lo sviluppo di trattamenti efficaci o profilassi. Ciò richiede l'uso di modelli animali di sepsi per comprendere meglio i processo e test possibili interventi. Inoltre, roditori adulti rispondono in modo diverso alla sepsi, con differenze statisticamente significative nel numero di batteri per amministrare per ottenere la stessa dose mortale (LD) e le differenze nella risposta dell'ospite risultante rispetto ai neonati2. Così, sepsi neonatale deve essere studiato in neonati. Diversi modelli di adulto sepsi sono stati utilizzati nella ricerca di sepsi. Questi includono una sfida endovenosa con specifici organismi implicati nella sepsi umano adulto o legatura e puntura cecal (CLP). CLP è un modello di endogeno sfida dove l'intestino cieco è chirurgicamente isolato, legato e forato per permettere la fuoriuscita del contenuto intestinale nel peritoneo, portando infine alla diffusione sistemica dei microbi e dei loro prodotti3. Tuttavia, la procedura chirurgica necessaria per stabilire CLP è letale per gli animali appena nati; Pertanto, un metodo alternativo è necessario di imitare la sfida polimicrobica della CLP per indurre sepsi neonatale. Il modello cecal liquami per sepsi polimicrobica neonatale è stato sviluppato per soddisfare questa esigenza, per cui il contenuto cecale di animali è raccolte, sospesa in sterile di destrosio 5% in acqua (D5W) e iniettato intraperitonealmente in topi neonati2. Questo è, dal momento che, diventata un modello sempre più popolare per lo studio di sepsi negli animali sia neonati e adulti e sostanzialmente ha avanzato intuizioni meccanicistiche della malattia processo4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Dato il crescente utilizzo di questo modello e desiderio di ricercatori di confrontare direttamente i risultati in pubblicazioni, c'è una necessità per gli aspetti tecnici di essere ben descritti e standardizzati attraverso gli studi. Standardizzazione si applica a tre aspetti del modello, vale a dire, i) la preparazione del brodo cecal liquami, ii) la preparazione delle aliquote sfida per iniezione in animali da esperimento e iii) la definizione dell'endpoint umano per cui gli animali sono da considerarsi giormi negli esperimenti di sfida. In particolare, metodi per preparare il brodo di liquami cecal spesso viene fatto riferimento all'articolo originale introducendo il modello2. Un breve riassunto di quel modello è che contenuto cecale da topi adulti era raccolte, sospesa in D5W sterile ad una concentrazione di 80 mg/mL e utilizzato all'interno di 2 h per iniettare gli animali sperimentali. Questo modello originale usato i topi della stessa età, dalla stessa posizione di venditore, che sono stati alloggiati nelle proprie strutture di ricerca rispettivi per meno di 2 settimane prima della raccolta contenuto cecale. L'uso di topi cresciuti in casa, anche se riducendo il costo da fornitore regolare consegna e consentendo l'uso di topi in eccesso di una più vasta gamma di età e sesso, anche sostanzialmente aumentato donatore a donatore variabilità. Questo ha motivato lo sviluppo di una tecnica alternativa, per cui contenuto cecale da topi multipli sono stati riuniti insieme per preparare un grande magazzino, che era poi aliquotati e conservati a-80 ° C13. Questo metodo alternativo è stato adattato da più gruppi14,15. Tuttavia, tale adeguamento ha provocato alcune varianti tecniche, sia il supporto di memorizzazione utilizzato (10% o 15% glicerolo, o D5W da solo) e nella strategia di filtrazione per rimuovere il particolato (filtraggio multistadio attraverso un 860 µm e, quindi, un 190 µm filtro o individuo filtrazioni attraverso 100 µm o 70 µm filtri)13,14,15. L'iniezione di glicerolo da solo potrebbe potenzialmente causare danni, dato che le iniezioni di glicerolo di 25% - 50% sono state usate come un modello del roditore di lesione renale16,17,18,19, 20. Per evitare effetti collaterali indesiderati di glicerolo, la preparazione di impasti cecal liquami per topi in questo studio è congelata nel D5W senza glicerolo, e vengono eseguiti test di vitalità batterica da conservazione a-80 ° C. La strategia di filtrazione utilizzata in questo studio è un passaggio attraverso un filtro 70 µm, che direttamente non è stato paragonato ad altre strategie di filtrazione elencate.
Dosi letali di peso-regolato di liquami cecal iniettata possono variare da struttura a struttura e devono essere titolate fuori per la letalità desiderata per i singoli gruppi. Con le dosi differenti di sfida, i volumi di sfida accompagnamento cambiare dalla necessità. Tuttavia, questo dettaglio metodologico non è stato segnalato prima. Inoltre, strategie per le procedure standard, come ad esempio l'iniezione intraperitoneale, raramente sono elaborate all'interno della letteratura, ma tecniche individuali possono influenzare se topi neonati una perdita quando iniettato e loro risultati finali l'impatto.
Benessere degli animali, tra cui una definizione di endpoint umano, è un aspetto centrale di questo modello e in qualsiasi modello di infezione e infiammazione in roditori21. Nel 1998, il Consiglio canadese su cura (CCAC) ha pubblicato linee guida estese per selezione umana degli endpoint, definendo l'endpoint umano come "qualsiasi effettivo o potenziale dolore, angoscia o disagio dovrebbe essere ridotta a icona o alleviato scegliendo il più in anticipo endpoint che è compatibile con gli obiettivi scientifici della ricerca"22. Altri anche attenzione che deve essere stabilito humane endpoint basati sulla giustificazione scientifica, piuttosto che su un'interpretazione soggettiva dell'animale stato solo21. Mentre c'è una ricchezza di risorse per cliniche, comportamentali e ai criteri basati a segno corpo-condizione per endpoint umano, anche nel contesto dell'infezione e l'infiammazione in particolare21,23,24, nessuno di questi , compresi gli orientamenti CCAC per endpoint humane22, menzionare topi neonati. Così, oggettivamente e scientificamente giustificato humane endpoint sono molto più difficili da stabilire per animali appena nati, dato le loro limitate capacità comportamentali sia la mancanza di prove da criteri, quali la perdita di peso, che è comunemente usato per l'adulto topi. Attualmente, i criteri per l'endpoint umano utilizzato per 5 - a 12-giorno-vecchio topo neonato nella letteratura cecal liquami tutti fanno riferimento al manoscritto originale che ha introdotto il modello2. In questa carta originale, la definizione di endpoint humane per animali neonati era basata su due criteri; vale a dire, la posizione del mouse di fuori del nido (scattering) e la mancanza di macchie di latte era stato visto a causare la morte entro ore. Una questione che complica nell'assegnazione di un endpoint di tipo umano è che latte macchie diventano difficili da vedere in diversi ceppi di topi con pelliccia scura, come ad esempio il ceppo C57BL/6J comunemente impiegato, dopo la prima settimana di vita, mentre gli animali malati vengono monitorati fino al 14 ° giorno di vita (DOL). Ulteriori, morti animali possono trovare postchallenge quando si applicano questi criteri (il proprietario di osservazione; inedito); così, una definizione più rigorosa di endpoint umano è necessaria per alleviare le sofferenze agli animali da esperimento ed evitare la mortalità in situazioni dove il risultato potrebbe essere accuratamente individuato in precedenza.
Tutti i tre aspetti metodologici del modello cecal liquami sono presentati in una procedura operativa standard dettagliare la preparazione dello stock cecal liquami, un metodo per l'iniezione di animali da esperimento che mantiene la costante di volume di iniezione tra le dosi e riduce il rischio di perdite e una definizione di endpoint humane per 7 - a-giorno-topi di 12 basato su un sistema di modellazione comportamentale. Informazioni comportamentali dei punteggi di salute del mouse da oltre 240 animali da esperimento è stato raccolto e raggruppati per risultato finale di sopravvivenza, dimostrando una definizione basata su prove dell'endpoint humane. La sofferenza degli animali da esperimento è ridotto identificando moribondi topi neonatali nel punto più in anticipo di tempo possibile, mentre i risultati biologicamente significativo di sopravvivenza possono dedurre osservando le variabili chiave. La rappresentazione visiva di preparazione cecal liquami e di comportamenti del mouse neonatale servirà come una risorsa eccellente per qualsiasi gruppo studiando sepsi o sfida neonato modello animali.
Protocol
Tutti gli esperimenti in questo protocollo sono stati approvati dal comitato di University of British Columbia animale cura sotto numero di protocollo A17-0110.
1. sterilizzazione di strumento
- In una cappa di sicurezza biologica (BSC), accendere e preriscaldare lo sterilizzatore tallone caldo a 250 ° C, per almeno 30 minuti prima dell'uso.
- Immergere gli strumenti in etanolo al 70%.
- Immergere gli strumenti nello sterilizzatore tallone caldo preriscaldato per un minimo di 1 min.
Nota: I manici degli strumenti si surriscalda e possono bruciare se lasciato nello sterilizzatore caldo perlina per oltre 1,5 min. - Spruzzare una stuoia di asciugamani di carta con etanolo al 70% per sterilizzarlo.
- Rimuovere gli strumenti dallo sterilizzatore caldo tallone senza toccare la parte sterilizzata dello strumento per le maniglie non sterili di altri strumenti di sommersi e metterli sugli asciugamani di carta etanolo-spruzzato.
- Attendere per 30 s a 2 min per gli strumenti di raffreddare prima di utilizzarli per la dissezione.
2. preparazione cecal liquami
- Preweigh provette per centrifuga da 15 mL (un tubo per ogni cinque topi euthanized).
- Eutanasia donatori cecal liquami secondo linee guida locale cura degli animali, o utilizzare il protocollo sottostante.
Nota: Fino a 40 topi C57BL/6J tra 6 e 12 settimane vecchio sono stati utilizzati per la preparazione di liquami cecal, con fino a cinque topi eutanasizzati alla volta.- Trasferimento i topi alla camera di eutanasia e impostare la macchina di anestesia di isoflurane al 5% con perfusione di ossigeno.
- Monitorare i topi per osservare la perdita della capacità di muoversi e di vederli entrare il piano chirurgico dell'anestesia e infine, smettere di respirare.
- Rimuovere un mouse dalla camera di eutanasia, pizzicare la zampa e osservare qualsiasi gamba retrazione o inalazione. Se uno è presente, è possibile restituire il mouse alla camera di eutanasia. in caso contrario, continuare.
- Terminalmente eutanasia i topi da dislocazione cervicale acuta.
- Eseguire la dissezione dell'intestino cieco, utilizzando strumenti presterilizzati e raffreddati (vedere sezione 1) in un BSC.
- Appuntare le gambe del mouse ad un Consiglio di polistirene espanso estruso usando gli aghi 23 G in modo che il mouse ha il suo addome fino. Sicuro e poi spruzzare l'addome con etanolo al 70%.
- Con delle forbici, pinze sterili, tagliare attraverso la pelle, allentare la pelle dal rivestimento peritoneale con le forbici e taglio aperto un'area rettangolare da inguine a sterno e lato sinistro al lato destro. Rimuovere qualsiasi pelliccia dal peritoneum.
- Passare a un nuovo paio di strumenti sterili per tagliare attraverso il peritoneo, rendendo un'apertura rettangolare, come è stato fatto per la pelle, strumenti di commutazione se quelli utilizzano a contatto della pelle.
- Identificare l'intestino cieco, che dovrebbe essere in esecuzione sinistra a destra attraverso il corpo. Interferire con tessuto connettivo per identificare i rami di intestino cieco dagli intestini e tagliare l'intestino cieco dall'intestino. Posto il cieco su un foglio sterilizzato di pesatura carta.
Nota: Carta di pesatura possa essere sterilizzato o spruzzando con etanolo al 70% su entrambi i lati e lasciandola asciugare, o di irradiazione UV. In alternativa, il cieco può essere sezionato su una piastra di Petri sterile.
- Estrusione di contenuto cecale
- In una BSC, è possibile utilizzare strumenti sterili per tagliare attraverso entrambe le estremità dell'intestino cieco.
- Tenere la metà dell'intestino cieco con pinze sterili e utilizzare una spatola di metallo piatto sterile per spingere delicatamente il contenuto cecale dal taglio finisce, usando un movimento di rotolamento ed evitando un movimento raschiatura che potrebbe strappare l'epitelio. Raccogliere il contenuto e inserirli in una provetta da centrifuga prepesati 15 mL.
- Piscina il contenuto cecale da un massimo di cinque topi nel tubo stesso. Pesare il tubo ancora una volta tutti i contenuti sono stati aggiunti.
Nota: Si aspettano una media di 300 mg e fino a 390 mg di cecal liquami per topo, che richiedono 1,8 a 2,4 mL di D5W per risospensione del mouse; quindi, utilizzando più di cinque topi durante questo passaggio può provocare eccessivo riempimento della provetta da centrifuga da 15 mL. - Pulire gli strumenti con un tovagliolo di carta etanolo-spruzzato e risterilizzare loro ripetendo i passaggi 1.2-1.6.
- Filtrazione liquami cecal
- Pesare la provetta riempita con contenuto cecale e calcolare la quantità di D5W da aggiungere al contenuto cecale dividendo il peso del contenuto cecale per ottenere la concentrazione desiderata stock in milligrammi per millilitro, come l'equazione seguente.
- In una BSC, aggiungere la quantità necessaria di D5W ghiacciata la provetta da centrifuga da 15 mL contenente il contenuto cecale.
- Vortice il 15ml Centrifugare la provetta verticalmente e orizzontalmente per 30 s. Check per particolato pari a più di 1-3 mm di diametro e se presente, continuare nel vortex fino a quando tutte le particelle grandi visibilmente sono scomparso.
- Posizionare un colino di cella 70 µm sterile in una provetta da centrifuga 50 mL che viene immesso sul ghiaccio. Dispensare 4 mL di sedimento centrifuga liquami cecal nel filtro delle cellule e, quindi per il tubo di raccolta. Risospendere il particolato pipettando su e giù per 2x x-3. Estrudere delicatamente le bolle per aumentare la velocità di filtraggio, mescolando il contenuto con la punta della pipetta fino a quando non ci sono nessun goccioline più filtrate.
Nota: Durante la miscelazione, ci potrebbe essere del particolato sufficiente per inserire la pipetta 5ml. In questo caso, ripetere il Vortex dal punto 2.5.3 e se la soluzione ancora non spezzare, utilizzare la pipetta per premere il particolato contro la parete della provetta da centrifuga. - Ripetere il passaggio 2.5.4, cambiando i filtri cella tra ogni tubo di liquami cecal e piscina tutti i contenuti nella stessa provetta da collezione 50ml centrifuga tenuta su ghiaccio, o in una provetta da centrifuga 50ml seconda se il volume del filtrato supera il livello di ghiaccio nella finestra di ghiaccio.
- Pesare la provetta riempita con contenuto cecale e calcolare la quantità di D5W da aggiungere al contenuto cecale dividendo il peso del contenuto cecale per ottenere la concentrazione desiderata stock in milligrammi per millilitro, come l'equazione seguente.
- Aliquota del liquame cecal.
- Se applicabile, combinare tubi multipli dal passaggio 2.5.5 in un contenitore sterile più grande (ad esempio, una bottiglia di deposito di 1.000 mL) filtrato cecal liquami di 50 mL. Quindi, vortexare per 15 s e posto 20 mL in una provetta da centrifuga 50 mL nuovo.
- Vortice lo stock di liquami cecal che è nel tubo 50ml centrifuga per 5-10 s e aliquota 500 µ l in tre fiale criogeniche da 2 mL che hanno una guarnizione di gomma, per evitare l'evaporazione nel corso del tempo. Immediatamente mettere il brodo di master e aliquotati vial criogeniche sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi 2.6.1 e 2.6.2 finché tutto il liquame cecal è stato aliquotati, Vortex stock master dopo ogni tre fiale criogeniche per evitare la sedimentazione delle particelle e al mantenimento di una miscela omogenea.
- Congelare le aliquote di liquami cecal a-80 ° C.
Nota: Aspettare tra tre o quattro flaconcini stock a 500 µ l di ogni topo adulto. Ogni flaconcino stock dovrebbe essere abbastanza approssimativamente alla sfida una cucciolata di otto topi a DOL 7.
3. sfida sepsi di topi neonatali 7-giorno-vecchio
- Separare, identificare e pesare topi neonatali.
- In una BSC, trasferire i topi neonatali per una nuova gabbia per tenere i topi lontano la diga e per ridurre lo stress alla diga.
- Rimuovere e strofinare la parte del materiale di nidificazione con guanti di trasferire odore di gabbia per i guanti. Modellare il materiale di nidificazione in un nido più piccolo, quindi inserirlo in una nuova gabbia senza la diga.
- Trasferire i topi neonatali per il materiale di nidificazione nella nuova gabbia.
- Trasferimento più materiale di nidificazione per rendere un nido vuoto, secondo nella nuova gabbia.
- Chiudere e rimuovere gabbia della diga dalla cappa, in modo che la diga non è sollecitata dall'ascoltare qualsiasi di afflizione di topi neonatali.
- Per tenere traccia di topi neonatali individuali all'interno della cucciolata nel corso del tempo, utilizzare un marcatore di etanolo-prova per contrassegnare uno a cinque punti sulla parte anteriore o l'inverso della coda, riapplicare ogni 12-24 ore se necessario.
- Pesare ogni mouse che sarete sfidati, posizionando ciascuno in secondario nido dopo la pesatura e ripetere questa operazione per tutti i topi.
- Restituire l'intera cucciolata alla diga prima di preparare la sfida di liquami cecal aliquota.
- Calcolare le dosi individuali peso-registrata di liquami cecal e necessaria diluizione con D5W completare questo passaggio per ogni cucciolata separatamente, utilizzando i calcoli qui sotto o utilizza il foglio di lavoro fornito (Vedi File supplementare).
- I milligrammi di cecal liquami (un) da somministrare a ogni mouse moltiplicando il peso del mouse in grammi (b) per calcolare la dose desiderata sfida in milligrammi di cecal liquami per grammo di mouse (c).
- Calcolare il volume individuale di stock non diluito liquami cecal necessaria per topo in microlitri (d) dividendo i milligrammi di liquami cecal necessari per topo dal punto 3.2.1 (un) dalla concentrazione stock cecal liquami, 160 mg di liquami cecal per millilitro di D5W (e) e moltiplicando per 1.000 µ l per millilitro per convertire da millilitri a microlitri.
- Media il volume stock di liquami cecal richiesto per topo (g) sommando il volume delle scorte cecal liquami (d) per topo in una cucciolata di topi n , diviso per il numero di topi (n).
- Calcolare il fattore di diluizione media per lo stock di liquami cecal (h) dividendo il volume di iniezione medio (100 µ l) di volume stock medio di liquami cecal necessaria per topo (g).
- Calcolare il volume di iniezione specifici di ogni mouse in microlitri (j) moltiplicando il volume di ogni mouse di liquami cecal stock richiesto (d) per il fattore di diluizione media (h) e quindi arrotondare alla decina più vicina (per abbinare il 10 µ l con incrementi della siringa di iniezione).
- Calcolare il volume medio di D5W per diluire lo stock di liquami cecal (k) sottraendo lo stock medio cecal liquami (g) dal volume di iniezione medio (100 µ l).
- Calcolare la quantità totale di liquami cecal stock in microlitri (l) moltiplicando il liquame cecal stock medio per topo in microlitri (g) per il numero di topi in questa cucciolata (n) e moltiplicando per 1.4 per creare supplementare.
- Calcolare la quantità totale di D5W in microlitri (m) necessario per diluire lo stock di liquami cecal moltiplicando il volume medio di D5W (k) per il numero di topi (n) e moltiplicando per 1.4 per creare supplementare.
- I milligrammi di cecal liquami (un) da somministrare a ogni mouse moltiplicando il peso del mouse in grammi (b) per calcolare la dose desiderata sfida in milligrammi di cecal liquami per grammo di mouse (c).
- Preparare l'aliquota di sfida dopo aver calcolato la quantità di liquame cecal stock richiesto (l dal punto 3.2.7). In una BSC, scongelare il numero richiesto di fiale stock cecal liquami a temperatura ambiente, mescolare il suo contenuto di pipettaggio.
- Quando ci sono non più visibili cristalli di ghiaccio presenti nel liquame cecal scongelato, trasferire la quantità calcolata di liquami cecal stock (l dal punto 3.2.7) ad un tubo del microcentrifuge sterile 1,8 mL.
- Diluire alla concentrazione richiesta aggiungendo D5W ghiacciata come calcolato al punto 3.2.8 (m). Conservare l'aliquota di sfida sul ghiaccio.
- Prima di caricare la siringa, mescolare il tubo del microcentrifuge da sfogliando 20x, seguito da 3 x di stesura ed espellendo 300-500 µ l di liquami cecal con una siringa di insulina ½ pollice di 500 cc 28 G.
- Redigere all'incirca 150 µ l di liquami cecal diluito nella stessa siringa.
- Scorri la siringa per sloggiare le bolle dallo stantuffo, tirarsi indietro leggermente sulla siringa e poi espellere le bolle.
- Dispensare il liquame cecal in eccesso indietro nel tubo del microcentrifuge fino la corretta quantità di liquami cecal per un mouse, come è stato calcolato per topi individuali al punto 3.2.5 (j), è caricato nella siringa.
- Intraperitonealmente iniettare cecal liquami, secondo le linee guida di istituzione di cura degli animali locali pertinenti, o utilizzare la procedura descritta di seguito.
- In una BSC, è possibile separare i topi neonatali dalla diga come descritto al punto 3.1.
- Collottola il mouse dalla parte posteriore del collo, utilizzando il pollice e il dito indice.
- Garantire la coda di topo attraverso la parte posteriore del medio e anulare, o sulla parte anteriore delle dita anello e pinky.
- Per ridurre le perdite, inclinare il mouse neonatale, in modo che si affaccia verso il basso e inserire la smussatura dell'ago dell'ago rivolto verso l'alto, tra la gamba e i genitali, mantenendo l'ago superficiale e sottocutaneo.
- Quando l'ago è inserito per 1 cm, premere verso il basso e in avanti per sentire l'ago puntura il peritoneo. Spingere lentamente lo stantuffo, mantenendo la punta dell'ago come costante come possibile, come i movimenti laterali potrebbero danneggiare gli organi del mouse.
- Estrarre delicatamente l'ago sopra 5-10 s, seguendo lo stesso percorso fuori come in, rilassante il dito medio durante la rimozione per ridurre la tensione nel corpo del mouse.
- Per controllare eventuali perdite, tenere premuto il mouse per alcuni secondi dopo la rimozione dell'ago permettere al sito di iniezione per chiudere e osservare qualsiasi perdita o rigonfiamenti al sito di iniezione, al punto che il mouse non deve essere utilizzato nell'analisi.
Nota: Rigonfiamento della pelle al sito di iniezione indica un'iniezione intraperitoneale non riuscita, con injectant essendo sottocutaneo. - Posizionare il mouse su un tovagliolo di carta e consentire il mouse per fare un passo. Se il mouse è immobile per 5 s, quindi premere leggermente la coda.
- Prendere il mouse e controllare per eventuali perdite di liquami cecal al sito di iniezione. Se c'è una perdita, escludere il mouse dall'analisi ed eutanasia il mouse.
4. Mouse monitoraggio
- Monitorare i topi regolarmente per verificare le loro per giungere a un endpoint di tipo umano.
- Osservare i topi postchallenge 2h per complicazioni correlate all'iniezione.
- Monitorare il postchallenge di 12h di topi per morbosità relativa a sepsi e l'identificazione dei topi a un endpoint di tipo umano (Vedi punti 4.2-4.3 per criteri).
- Successivamente è possibile monitorare ogni 4-6 h per i primi 2 giorni, ad eccezione di 8 h durante la notte, quando i topi neonatali sono incustoditi.
- Oltre 2 giorni postchallenge, monitorare x-2 1 x al giorno. Se malato si osservano topi o topi cui Punteggio salute diminuisce, quindi aumentare la frequenza di monitoraggio per ogni 4-6 h.
- Monitoraggio topi neonatali
- Per qualsiasi routine che coinvolgono topi neonatali, trasferire la biancheria da letto di materiale per una nuova gabbia come descritto al punto 3.1 (per gli stessi motivi come accennato ci). Controllare attentamente per eventuali neonati che vengono trascinati dal nido durante l'allattamento. Qualsiasi topi che vengono trascinati fuori la lettiera durante l'allattamento non dovrebbe essere sparsi in topi.
- Quando si rimuove la parte superiore del nido, identificare qualsiasi dispersione di topi neonatali sia dal nido o bloccato nel materiale di nidificazione, ma lontano dal loro littermates, con l'eccezione di topi trascinati via la lettiera durante l'allattamento. Fare riferimento all'endpoint humane criteri nel passaggio 4.5 se un mouse viene trovato sparsi.
- Misurare i topi raddrizzante riflessi e mobilità.
- Su un tovagliolo di carta, posizionare il mouse sul dorso e monitorare per la sua capacità di giusto per sé entro un massimo di 4 s. Collocato sul dorso, caduta il mouse a sinistra o a destra, che è quando inizia il conteggio di s 4.
Nota: Per essere classificate nel gruppo "Diritti", il mouse deve essere in grado di ottenere almeno tre o quattro zampa rilievi sul tovagliolo di carta per 1 s. Ancora è raggruppato come potendo giusto per sé se cade.- Se il mouse può giusto per sé, quindi attendere 8 s per determinare il suo livello di mobilità.
- Categorizzare il mouse come "Diritti-Mobile" se può giusto per sé ed esplorare il suo ambiente prendendo più passaggi di fila.
- Categorizzare il mouse come "Diritti-letargico" se può giusto per sé e fare qualche passo per esplorare il suo ambiente. I topi in questo gruppo possono cadere durante l'assunzione di un passo, guardare traballanti sui loro piedi e mettere in pausa tra i passaggi.
- Categorizzare il mouse come "Diritti-Nonmobile" se può giusto per sé, ma non si muove intorno un sacco. Ancora cadere, e se non prende tutte le operazioni all'interno di 8 s, è raggruppato come diritti-Nonmobile.
- Se il mouse non poteva giusto per sé, quindi categorizzare sua mobilità basato sul movimento dell'anca osservato.
Nota: Evitare di ripetere il monitoraggio o aumentando la lunghezza di tempo che il mouse passa sulla loro parte posteriore perché questo potrebbe influenzare il sistema di punteggio e l'endpoint humane, come un mouse che non riesce a giusto per sé all'interno di 4 s può a volte farlo se dato più tempo.- Categorizzare il mouse come "non riescono a destra (FTR)-Mobile" se è incapace di giusto per sé e visualizza il movimento dell'anca che supera l'angolo di 90° dalla posizione orizzontale. Alcuni topi possono destra essi stessi se dato più di 4 s, ma dovrebbe ancora essere classificati come FTR, con gol di mobilità basato sul movimento dell'anca.
- Categorizzare il mouse come "FTR-letargico" se è incapace di giusto per sé e visualizza il movimento dell'anca sotto angolo di 90° dall'orizzontale.
- Categorizzare il mouse come "FTR-Nonmobile" se è in grado di giusto per sé e ha le gambe che scuotere o vibrano ma nessun movimento dell'anca. Gli arti possono estendere o ritrarre ma fare non avere movimento laterale. Il mouse è visibilmente malato e ha raggiunto l'endpoint humane.
- Su un tovagliolo di carta, posizionare il mouse sul dorso e monitorare per la sua capacità di giusto per sé entro un massimo di 4 s. Collocato sul dorso, caduta il mouse a sinistra o a destra, che è quando inizia il conteggio di s 4.
- Ripetere il passaggio 4.3 sul lato opposto del mouse, registrare entrambi i lati.
Nota: Vedere il File supplementare per la registrazione delle osservazioni. - Determinare se il mouse è un endpoint di umano e richiede l'eutanasia come evidenziato nella tabella 1e di sotto.
- Classificare i topi in raddrizzamento diverse e livelli di mobilità basati sulle osservazioni monitoraggio osservate ai punti 4.3 e 4.4. Mobilità del mouse viene misurata per ogni lato, e il comportamento mobile è utilizzato per determinare se il mouse richiede l'eutanasia.
- Assegnare qualsiasi topi con un raddrizzamento reflex di FTR-Nonmobile (a) o (b) FTR-letargico e trovati separato dal nido a un endpoint di tipo umano.
- In punti di tempo di là di postchallenge di 20h di monitoraggio, classificare qualsiasi mouse con un riflesso di raddrizzamento della "non riescono a destra" su entrambi i lati come a un endpoint di tipo umano, perché i dati presentati predicono con elevata precisione che questi topi alla fine soccombono alla malattia e non recuperare.
- Topi separati che devono essere euthanized, come determinato al punto 4.5. Se il mouse monitorato non è visto come un endpoint di umano, posto nel secondo nido vuoto nella nuova gabbia senza la diga e continuare con altri topi neonatali.
- Una volta che è stata monitorata l'intera cucciolata, spostare la metà del materiale di nidificazione nella gabbia con la diga, riformando un nido con camera nel mezzo per i topi neonatali.
Nota: Un nido di formato errato potrebbe causare i topi a dispersione e ridurre la quantità di cura disponibile che la diga può offrire. - Trasferire i topi neonatali torna nella gabbia con la diga.
- Racchiudere la lettiera nel nido mettendo il materiale di nidificazione rimasto sopra la lettiera e si pizzicare delicatamente intorno al coperchio per proteggere il materiale di nidificazione in luogo.
- Eutanasia i topi neonatali separati nel passaggio 4.6 secondo i requisiti di istituzione locale.
5. titolazione del liquame cecal
- Sfida i topi alla dose desiderata sfida (sezione 3) e monitorare i risultati (sezione 4).
- Osservare se il risultato finale si traduce in LD desiderata e se non, ripetere i punti 3 e 4 con una nuova cucciolata ad una dose di sfida superiore o inferiore, la regolazione di 5-10%.
Nota: Le dosi di sfida possono essere simile alla Figura 1B ma devono essere titolati in ogni impianto e ceppo di topi. - Inoltre, osservare se i topi raggiungere un endpoint umano più veloce o più lento rispetto la cinetica prevista in Figura 1Be ripetere le sezioni 3 e 4 con una nuova cucciolata ad una dose di sfida superiore o inferiore, la regolazione di 5-10%.
Representative Results
Redditività di liquami cecal conservati a-80 ° C può essere testato nel tempo di diluizione in serie e di placcatura aliquote di stock di liquami cecal su agar soia triptico con sangue di montone al 5% seguita da 24 h di incubazione aerobica a 37 ° C. Successivo conteggio culturable contenuto formanti colonie unit (CFU) di una preparazione di liquami cecal è stato trovato non per cambiare nel corso di un periodo di 6 mesi, e la redditività non è stata colpita da una conservazione prolungata a-80 ° C (Figura 2). Ogni mouse donatore ha provocato, in media, abbastanza cecal liquami per sfidare tre o quattro cucciolate (dati non mostrati).
Topi sfidati a DOL 7 con liquami cecal per indurre la sepsi polimicrobica ha cominciato a raggiungere l'endpoint umano entro 12 h della sfida, e la sepsi polimicrobica principalmente è stato risolto da postchallenge di 48h, come osservato in una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier combinato da dati di oltre 200 topi sfidati (Figura 1A). La letalità era dipenda dalla dose di sfida amministrato, con una variazione del 5% in dose challenge conseguente un circa 15% di differenza nel tasso di sopravvivenza (Figura 1B). Il peso del corpo del mouse è stato misurato a ogni visita di monitoraggio. Perdita di peso è stata veduta in tutti gli animali sfidati, essendo non discriminatorio tra topi che ha finito per sopravvivere e quelle che non ha fatto durante le prime 24 h postchallenge (Figura 1). Dopo 24 h, gli animali più sopravvissuti cominciarono a riconquistare il loro peso, mentre tutti i giormi ha continuato a perdere peso e si trasferì a loro endpoint humane. Tuttavia, una piccola percentuale di sopravvivenza di animali che avevano mantenuto il loro riflesso di raddrizzamento inoltre ha continuato a perdere peso o è riuscito a guadagnare peso, fino alla fine dell'esperimento, anche perdere tanto quanto il 20% del loro peso corporeo iniziale all'interno di 40 h della sfida. Come c'era una sovrapposizione di perdita di peso fra i topi che ha finito per sopravvivere e coloro che non hanno fatto, variazioni di peso o di una soglia di perdita di peso potrebbero non essere utilizzato come criterio per endpoint umana pur mantenendo l'obiettivo di dividere con precisione i sopravvissuti da giormi.
Il comportamento dei topi è stato monitorato come descritto nel protocollo e nella tabella 2. Istantanee della salute le categorie sono visualizzate (Figura 3A-C). Queste foto mostrano le categorie differenti di salute di topi che non hanno essi stessi a destra dopo essere stato messo sulla loro schiena e delineare la differenza tra FTR-Mobile e FTR-letargico, che è una distinzione importante. Topi sani incontrastati di questa età non visualizzano l'attività FTR-letargico; Pertanto, questa categoria di salute è un marcatore della malattia e una risposta alla sfida. Malato topi visualizzato sintomi FTR-letargico (Figura 3B) e potrebbero regredire verso FTR-Nonmobile (Figura 3), dove la parte superiore della gamba rimane parallelo con fondo gamba, con poca o zero anca a dondolo movimento, che è uno dei criteri per endpoint di umano. I topi potrebbero anche recuperare, aumentato movimento dell'anca, diventando FTR-Mobile (Figura 3A). Il riflesso di raddrizzamento e mobilità punteggi sono stati determinati per il sinistro e il lato destro di ogni mouse, e il punteggio più alto è stato utilizzato per determinare se il mouse aveva raggiunto un endpoint di tipo umano. Comportamentali sono stati raccolti da oltre 240 animali sfidati con una dose letale 60 (LD60) di liquami cecal e 144 humane endpoint sono stati osservati (Figura 3D-F e tabella 1). Questo approccio basato su prove è stato utilizzato per definire e perfezionare l'endpoint umano attraverso quattro fasi di malattia, classificati dagli sperimentatori basati su entrambi differenze di comportamento tra i sopravvissuti e sopravviventi e dalla frazione di endpoint umano raggiunto durante ogni periodo di tempo. Durante i primi esperimenti, topi FTR-Nonmobile che non avevano nessun movimento dell'anca costantemente sono stati trovati morti all'interno di 4-6 h di questo comportamento osservato. Nella raccolta delle informazioni presentate, un punteggio di salute FTR-Nonmobile è stato utilizzato come criterio per un endpoint di tipo umano. Da postchallenge h 12-21, mentre sono stati eutanasizzati topi FTR-Nonmobile, superstiti sia tale in animali visualizzati modelli comportamentali molto simili e non potevano essere distinti in qualsiasi altro modo (Figura 3D). Da postchallenge 21-48 h, la maggior parte della sopravvivenza di topi ha riguadagnato il loro riflesso di raddrizzamento, mentre erano meno dell'1% dei comportamenti FTR osservati in animali che avrebbero continuato a sopravvivere all'esperimento (Figura 3E). Così, i topi che non è riuscito a destra se stessi da entrambi i lati è diventato un ulteriore criterio per endpoint umana durante questo tempo. Tra 12 e 20 h postchallenge, 12,5% del numero totale di endpoint umano sono stati osservati, contro 80,5% tra 20 e 48 h e il 7% dopo 48 h (tabella 1). Una caratteristica distintiva fra i topi che ha finito per sopravvivere e che alla fine ha peggiorato per un endpoint di tipo umano è stata la perdita del riflesso di raddrizzamento, indipendente della mobilità dell'anca (Figura 3F). Infatti, tra 20 e 48 h dopo la sfida, un totale di 121 topi non era riuscito a se stessi proprio da entrambi i lati, con 116 di questi topi, eventualmente procedendo a un endpoint di tipo umano (che rappresenta una precisione del 96% nell'identificare i topi che non avrebbero recuperato). Oltre 48 h dopo la sfida, 11 topi sono stati osservati a fallire a destra se stessi da entrambi i lati e 10 di questi progredito a un endpoint umano (un 91% di precisione). Oltre 20 h dopo la sfida, il numero di topi che perso il riflesso di raddrizzamento per entrambi i lati predice il risultato finale con una precisione di più di 90%; Pertanto, questo è stato aggiunto ai criteri di endpoint umano, per individuare nonrecovering topi prima e ridurre del mouse sofferenza (tabella 1).
La frequenza che topi bisogno monitoraggio cambia nel tempo, a causa dei diversi tassi di postchallenge di morte ed è descritto nella tabella 1. Un mouse è stato considerato come suo endpoint humane in qualsiasi punto, se non era riuscito a giusto per sé e visualizzato il movimento dell'anca mobili su entrambi i lati, o se il mouse è stato trovato sparsi dal nido, è riuscito a giusto per sé e aveva letargico movimento dell'anca. Topi con una di queste condizioni non dovevano essere in grado di ricongiungersi con la lettiera e sono stati osservati come FTR-Nonmobile entro 4-6 h. a partire 20 h dopo la sfida, un nuovo endpoint umano è stato aggiunto perché le informazioni presentate dimostrano che il vasto maggioranza dei topi che FTR da entrambi i lati finisce per soccombere alla malattia.
Il video, tabelle e risorse presentate in questo manoscritto sono una risorsa di insegnamento efficace per l'assegnazione del comportamento corretto dei topi sfidati. Sette sperimentatori furono chiesto di guardare il video di formazione e leggere il protocollo e le tabelle prima di assegnare i comportamenti 60 animali sfidati. L'identificazione di assegnazione humane endpoint era accurata sia per FTR topi dai topi che sono stati in grado di se stessi a destra all'interno del lasso di tempo consentito (e distintivo FTR-Nonmobile topi da topi che visualizzati gli altri comportamenti (Figura 4A) Figura 4B).
Figura 1 : Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier, titolazione della dose di liquami cecal e variazione di peso dopo la sfida di liquami cecal. (A) risultato di sopravvivenza dei topi C57BL/6J neonatali sfidati con un'iniezione intraperitoneale cecal liquami a DOL 7. Da esperimenti indipendenti utilizzando sfida più dosi, che variano da 0,7 a 1,3 mg di cecal liquami per grammo di peso corporeo è state somministrate a questi topi sono stati combinati i dati per questa figura. (B) neonatale topi sfidati con 0.80-0,95 mg di cecal liquami per grammo di peso corporeo da una preparazione di liquami cecal visualizzare una relazione dose-dipendente tra la quantità di liquame cecal dato e la percentuale di sopravvivenza. (C) la percentuale di cambiamento nel peso rispetto al peso di sfida, con la linea tratteggiata che indica una perdita del 20% di peso dal momento della sfida. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Concentrazione di CFU in magazzino di liquami cecal conservato a-80 ° C non cambia nel corso di un periodo di 6 mesi. L'effetto dell'età cecal liquami sulla concentrazione di CFU è stato testato utilizzando la regressione lineare. Ogni punto rappresenta un'aliquota della stessa preparazione cecal liquami, in serie diluito e placcato su un periodo di 6 mesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Hip categorie di mobilità dei topi che non riescono a destra se stessi e dei comportamenti animali varie volte postchallenge. Topi che sono stati sfidati con sepsi, quando posizionato sulla schiena, mostrerà segni di morbosità che può essere misurata dal grado di movimento dell'anca. (A) A fallire a destra (FTR)-Mobile mouse Mostra il movimento dell'anca a dondolo della loro parte superiore della gamba superiore a angolo di 90 ° dalla posizione orizzontale. (B) An FTR-letargico mouse spettacoli anca movimento oscillante ma non superi angolo di 90 ° da orizzontale in qualsiasi momento durante la 4 s di monitoraggio. (C) alcuni FTR-Nonmobile topi estenderanno loro gamba, piegando il ginocchio, ma mostreranno molto poco (meno di angoli di 10 °) a zero anca a dondolo movimento e le gambe rimarranno parallelo a vicenda. (D) i comportamenti animali 12-21 h postchallenge Mostra che solo i comportamenti FTR-Nonmobile separano sopravvissuti da giormi. (E) dal 21 al postchallenge di 48h, solo 4 i 592 comportamenti osservati FTR (0,67%) appartengono ai superstiti, che permette il raddrizzamento riflesso per prevedere l'esito finale ed essere usato come un nuovo criterio per endpoint humane. Un postinfection di (F), di là di 48 h, 6 su 131 topi (4,55%) che avevano un riflesso di raddrizzamento sono diventata parte del gruppo FTR e sono stati sacrificati alla fine dell'esperimento, che giustificano un monitoraggio continuo durante tutto il corso di recupero. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Risorse didattiche inclusi nella classificazione accurata del comportamento di sperimentatori indipendenti. Gli sperimentatori addestrati guardando il video che accompagna questo protocollo categorizzati video di 60 topi neonatali in salute differenti gruppi. (A) la capacità di distinguere un umano endpoint è stato determinato e una media del 97% dei comportamenti con precisione è stata categorizzata come FTR-Nonmobile o non, mentre solo l'1% dei topi di FTR-Nonmobile sono stati identificati in maniera errata. Due per cento dei topi sono stati falsamente identificati come FTR-Nonmobile. (B) l'identificazione del secondo endpoint humane criterium di distinguere correttamente tra FTR topi o quelli che hanno la capacità di destra se stessi all'interno di 4 s di essere collocato sulla loro parte posteriore è stato assegnato correttamente nel 97% dei punteggi, mentre solo 0.96% dei topi sono stati assegnati in modo non corretto come essi stessi di raddrizzamento e 2% dei topi sono stati assegnati in modo non corretto come FTR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Stadio di malattia | R: alta morbosità, nessuna mortalità | B: alta morbosità, mortalità bassa | C: alta morbosità, mortalità alta | D: bassa morbilità, mortalità di basso |
| Ore dopo la sfida | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| Frequenza di monitoraggio | sfida di post 2 h | ogni h 4−6 | Ogni 4−6 h, 8 h, incustodito durante la notte | 1 − 2 volte al giorno, più se necessario |
| Proporzione di endpoint umano totale osservato | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| Percentuale di endpoint humane osservato | 0% | 12,5% | 80,5% | 7% |
| Criteri dell'endpoint Humane | 1. FTR−Nonmobile su entrambi i lati | 1. FTR−Nonmobile su entrambi i lati | ||
| 2. disperso dal nido ed è FTR−Lethargic | 2. disperso dal nido ed è FTR−Lethargic | |||
| 3. FTR su sia di sinistra o di destra (con qualsiasi Punteggio di mobilità) | ||||
Tabella 1: frequenza di monitoraggio e umano i criteri dell'endpoint nelle diverse fasi della malattia. Monitoraggio frequenza, ha osservato humane endpoint, la percentuale di endpoint umano e i criteri dell'endpoint umana nelle varie fasi della malattia.
| Riflesso di raddrizzamento | Mobilità | Limite di tempo a destra dopo essere stato messo sul retro | Limite di tempo per misura di quantità di movimento (mobile / letargico / mobili) | Criteri di Punteggio di mobilità |
| Diritti | Mobile | 4 s | Un ulteriore 8 s | Il mouse richiede più passaggi di fila, mantenere lo slancio in avanti ed Esplora il suo ambiente. Pup non cadrà. |
| Letargico | Il mouse può fare un passo ma verrà interrompere e sospendere prima di prendere un altro. Pup possono cadere. | |||
| Nonmobile | Il mouse non prendere provvedimenti dopo raddrizzamento sé. Pup possono cadere. | |||
| Non riuscire a destra | Fianchi mobile | Stesso 4 s usato per misurare il riflesso di raddrizzamento | Ha energico movimento dell'anca con la parte superiore della gamba rotante oltre i 90° dall'orizzontale, almeno una volta all'interno di 4 s. | |
| Letargici fianchi | Movimento dell'anca fino a ma non oltre i 90° dalla posizione orizzontale. | |||
| Fianchi mobili | Membra può spostare di estensione e di ritiro, ma i fianchi non ruoterà. Pup sembra molto malato. |
Tabella 2: monitoraggio tabella e criteri nel determinare il Punteggio di salute dei topi. I criteri forniti sono stati usati per definire gruppi di categorie di salute ai topi e per ridurre la varianza individuale nell'assegnazione di punteggi di salute.
Discussion
Postnatali topi neonatali hanno molto limitato la mobilità e non riescono a se stessi a destra dopo essere stato messo sulla schiena, anche quando incontrastato. Da 7 DOL, l'età dei topi sfidati in questo modello, una gamma di movimento che spaziano dai diritti-Mobile a FTR-Mobile è stata osservata nei topi incontrastati, con una differenza importante, vale a dire che un mouse incontrastato a questa età non ha visualizzato il comportamento FTR-letargico. Sono stati osservati solo topi sfidati con sepsi polimicrobica diventare FTR-letargico; Pertanto, questa risposta può essere un indicatore della gravità della malattia. Essere attento per il taglio di un angolo di 90° dall'orizzontale per il movimento dell'anca consente l'assegnazione coerenza e preciso del movimento dell'anca letargico o mobile in topi. Il lasso di tempo di 4 s per vedere se un mouse può giusto per sé è stato selezionato perché incontrastati topi sono riusciti a destra costantemente se stessi entro questo lasso di tempo. Ripetuto la misura dello stesso mouse è stato evitato, mentre il tempo a destra se stessi e la misurazione della mobilità dell'anca è stata limitata a 4 s, per non affaticare eccessivamente il mouse, che altrimenti poteva influenzare la sua capacità di ottenere cibo e calore e poteva incidere sui suoi prognosi di stare meglio. Raddrizzamento sé da sinistra e destra sono stati osservati, e il più alto dei punteggi è stato utilizzato per determinare se il mouse è stato a un endpoint di tipo umano, perché alcuni topi sono stati trovati per visualizzare FTR-Nonmobile su un lato ancora hanno una maggiore mobilità da altro lato e b e in grado di recuperare alla fine.
Il sistema di punteggio utilizzato per valutare la salute del mouse invocata l'applicazione di tagli categorici a che cosa è una gamma di movimento e, di conseguenza, potrebbe essere soggetto a pregiudizi individuali. Il personale è stato addestrato insieme per garantire che ogni persona ha ottenuto i topi lo stesso; Tuttavia, probabilmente ci rimarrà un livello di soggettività che conduce alla variazione. La consistenza di punteggio è stata valutata avendo sette ricercatori che non avevano precedentemente effettuato il monitoraggio del mouse neonatale imparare i requisiti descritti in questo protocollo e video e, quindi, in modo indipendente assegnare comportamenti e determinare humane endpoint. Una precisione del 97% è stata osservata con il Punteggio effettuato su 60 topi sfidati, suggerendo che pregiudizi individuali non gioca un ruolo notevole nelle assegnazioni del comportamento di questo modello. Il protocollo di monitoraggio del comportamento presentato si basa su osservazioni di animali sfidati il DOL 7, ancora topi di età inferiore a 6 giorni in uno stato sano incontrastato costantemente non possono proprio essi stessi. Così, i criteri dell'endpoint umano descritto non potevano essere applicati direttamente ai più giovani topi. Se più giovani topi vengono utilizzati in questo modello sperimentale o se viene applicato un modello di sfida diversa con la cinetica di differenti di malattia, quindi i criteri dell'endpoint umano adatto devono essere sviluppati e pilotati per evitare l'eutanasia dei topi che sarebbe altrimenti, alla fine, recuperare. Il sistema di Punteggio Visualizza un metodo affidabile di migliorare la classificazione di endpoint umana che, con test e conferma, potenzialmente potrebbe essere applicato ad altri modelli.
Ogni preparazione di liquami cecal o l'uso di un nuovo ceppo del mouse necessaria la retitration della dose cecal liquami per amministrare per ottenere una simile dose letale. Ogni preparazione è stata standardizzata dalla lettura di interesse, vale a dire sopravvivenza, piuttosto che dare lo stesso conteggio batterico. Concentrazione batterica vitale di ogni preparazione liquami cecal variata leggermente, potenzialmente dovuto le differenze nei batteri commensali del donatore o a causa di variazioni del peso lasciato nel colino cella della postfiltration stock cecal liquami. Durante la titolazione del liquame cecal, le prime due cucciolate sono stati divisi in due gruppi e ogni metà della cucciolata sono stati sfidati con una delle due dosi, affinché ognuna delle dosi sarebbe stato testato in due cucciolate. Se il tasso di sopravvivenza risultante non corrisponde il livello richiesto, quindi la dose di sfida è stata aumentata o diminuita di 5-10% e l'esperimento ripetuto. Cucciolate multipli sono stati utilizzati per tenere conto delle differenze di cucciolata a cucciolata che potrebbero causare resistenza o aumentata suscettibilità alla sepsi attraverso una cucciolata. Era importante accuratamente titolo lo stock di liquami cecal con ogni nuova preparazione per garantire che la nuova titolazione del liquame cecal era paragonabile ai precedenti preparati cecal liquami. Periodi di rumore in eccesso e vibrazioni, in particolare durante la compattazione dell'asfalto e la costruzione di un edificio nelle vicinanze e la strada, sono stati osservati per aumentare lo sforzo nelle dighe. Questo correlato con i tassi aumentati di cannibalizzazione e colpite la mortalità degli esperimenti di sopravvivenza, anche che interessano topi incontrastati, indicando che ci può essere estranei impatti sulla sopravvivenza neonatale che anche bisogno di essere controllato per.
Metodi precedenti per preparazione impasti cecal liquami includevano l'impiego dei liquami cecal fresco o la preparazione di liquami cecal congelati, utilizzando una varietà di metodi, tra cui l'archiviazione in glicerolo che inevitabilmente verrebbero trasferito durante la sfida. Mentre l'impiego dei liquami cecal fresco fornisce il vantaggio di avere una composizione batterica più vicina ai contenuti cecali originali, c'è il rischio di varianza tra topi donatore individuale a causa della variazione di batteri commensali. Mentre questo è stato ridotto al minimo utilizzando cecali donatori dello stesso fornitore con un tempo minimo tra l'arrivo e la progressione dell'esperimento, questo potrebbe diventare un'opzione costo proibitivo per alcuni laboratori e ha presentato un'altra sfida logistica di temporizzazione nell'avere topi di pari età disponibili quando si inizia un impasto cecal esperimento in topi neonatali che erano vecchi di 7 giorni. È stato utilizzato un metodo alternativo all'utilizzo di liquami cecal fresco, dove contenuti cecal più adulto dei donatori sono stati riuniti, risospesi in D5W, congelati a-80 ° C senza glicerolo e scongelati un'aliquota a un tempo per gli esperimenti. L'utilizzazione dei liquami cecal donatori adulti studiare sepsis neonatale potenzialmente potrebbe trasferire la specie di batteri presenti nel liquame cecal che il mouse neonatale non è stato esposto a, ma è una strategia che consente lo studio di sepsis in topi neonatali e è stato utilizzato per studiare biologia del mouse neonatale nel passato13,14,15. Cecal liquami è stato diluito in D5W per fornire nutrimento per i batteri, che ha permesso l'istituzione di un'infezione attiva, una volta che i batteri sono stati iniettati ed è stato fatto per simulare la disponibilità di nutrienti nella cavità peritoneale durante necrotizzante enterocolite. Glicerolo non è stato incluso come un agente di stabilizzazione in batteri di congelamento a causa di potenziali effetti collaterali negativi che possono derivare da iniezione di glicerolo da solo. Se glicerolo era stato incluso nella preparazione cecal liquami, quindi i potenziali danni che glicerolo da solo potrebbe indurre avrebbe bisogno di essere testati per includendo una sola glicerolo (manca cecal liquami) iniezione in topi, che avrebbe aumentato mouse utilizzo. La vitalità di batteri delle scorte cecal liquami è stata testata dopo il congelamento lo stock di liquami cecal senza glicerolo ed è stata trovata per essere costante, con nessun cambiamento nella concentrazione di batteri in aliquote separate della stessa preparazione cecal liquami conservata a-80 ° C sopra un 6 periodo di mesi. Ciò suggerisce che il deposito senza glicerolo è fattibile nel fornire un coerenza risultato biologico. L'uso di una massa-preparato congelato stock cecal liquami anche permesso per l'uso di topi allevati in azienda, riducendo i costi e quindi utilizzando topi maschi che altrimenti sarebbero in eccesso da allevamento, riducendo gli sprechi del mouse.
L'identificazione delle sfide non riuscite in topi era importante evitare l'aggiunta di rumore supplementare al sistema. Dopo aver subito un'iniezione intraperitoneale di liquami cecal, i topi sono stati osservati per la presenza di un rigonfiamento sotto la pelle, che indicava un'iniezione fallito che era effettivamente sottocutaneo. Topi sono stati osservati per perdite al sito di iniezione, sia immediatamente dopo la rimozione dell'ago e dopo permettendo loro di fare un passo dopo l'iniezione, perché topi sarebbero a volte (raramente) una perdita solo dopo aver spostato la parte del sito di iniezione con un passo. La presenza di un rigonfiamento o perdita che segue l'iniezione ha provocato la rimozione del mouse dall'analisi. Dopo tutto, uno di questi potrebbe provocare un risultato diverso a causa della non corretta quantità di liquami cecal iniettato come una differenza di 5% in dose challenge è stata osservata per influenzare la sopravvivenza successiva.
Sfida di liquami cecal esperimenti spesso necessarie dosi letali di destinazione diverse con diverse dosi di peso-regolato. A causa di questo, i volumi di iniezione possono variare da appena 20 µ l e fino a 100 µ l. Errore sperimentale proporzionata associato con ago morto volume cambia anche con il volume di iniezione, aumentando la difficoltà per confrontare direttamente le dosi differenti. Con la semplice modifica di uniformare il volume di iniezione, questa fonte di varianza è rimosso dall'esperimento.
Sistema di monitoraggio del comportamento del mouse neonatale, utilizzata nel presente protocollo è il primo del suo genere. Intento di ricercatori per le ricerche etiche con topi neonati devono spesso affrontare l'impegnativa mancanza di risorse per valutare il benessere dell'animale a questa età. Il sistema di monitoraggio presentato intuitivo e coerenza comincia a colmare questa lacuna di conoscenza. D'importanza, questo approccio basato su prove non solo aumenta la qualità dei dati sperimentali ottenuti ma, allo stesso tempo, riduce anche la sofferenza degli animali da esperimento.
Disclosures
Dr. James Wynn riceve supporto da National Institutes of Health (NIH) / National Istituto delle scienze mediche generali (R01GM128452) e il NIHEunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) ( R01HD089939).
Acknowledgments
Speciale a Claire Harrison e l'Animal Care Facility presso British Columbia bambini Hospital Research Institute (BCCHR) per il loro supporto nel lavoro animale, così come al Dr. Po-Yan Cheng per loro guida e ingresso monitoraggio degli animali e sul benessere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
