تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة تبين نيون جديدة صبغة تقنية للكشف عن البروتين الكلي في الهلام بولياكريلاميدي. يستخدم البروتوكول تحقيق دورة على الأسفار الخاصة بايون فضة، الذي يكشف Ag+-البروتين المجمعات، ويزيل بعض القيود التقليدية البقع الفضية اللونية.
Abstract
تلوين الفضة أسلوب قياس ألوان المستخدمة على نطاق واسع لتصور نطاقات البروتين في المواد الهلامية polyacrylamide عقب الصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). وقد البقع الفضية الكلاسيكية بعض العيوب، مثل خلفية عالية تلطيخ، استرداد البروتين الفقراء، وانخفاض إمكانية تكرار نتائج، مجموعة ديناميكية خطي ضيقة للقياس الكمي، والتوافق محدودة مع الطيف الكتلي (مللي ثانية). الآن، مع استخدام مجس Ag+ فلوروجينيك، TPE 4TA، قمنا بتطوير فضية فلورسنت تلطيخ الأسلوب للتصور مجموع البروتين في المواد الهلامية بولياكريلاميدي. ويتجنب هذا وصمة عار جديدة بخطوة التخفيض الفضة مزعجة في البقع الفضية التقليدية. وعلاوة على ذلك، يوضح وصمة الفضة الفلورسنت إمكانية تكرار نتائج جيدة، وحساسية، والكمي الخطي في الكشف عن البروتين، يجعلها وصمة عار جل بروتين مفيدة وعملية.
Introduction
وكانت العديد من أساليب المصبوغة المستخدمة لتصور البروتينات بعد التفريد هلام، على سبيل المثال استخدام الأصباغ اللونية مثل “أخذ الأزرق الرائعة”، والفضة وصمة عار، والأسفار، أو المشعة وسم21،، 3 , 4-تلوين الفضة يعتبر أحد الأساليب الأكثر حساسية للكشف عن البروتين التي تتطلب الكواشف بسيطة ورخيصة. فإنه يمكن تصنيفها إلى عائلتين الرئيسية: وصمة وصمة الفضي أممونياكال ونترات الفضة5،6. في أسلوب الفضي أمونياكال القلوية، أنتجت مع هيدروكسيد الصوديوم والأمونيا المجمع ديامينى الفضة وخفضت إلى الفضي المعدني أثناء تطوير استخدام حل فورمالدهايد حمضية. وصمة عار يستوعب كفاءة للبروتينات الأساسية ولكن يظهر أداء الشبهة لبروتينات حمضية ومحايد وهو، علاوة على ذلك، يقتصر على جليكاين الكلاسيكية ونظم الغرواني الكهربي والتورين. في المقابل، استغلال البقع نترات الفضة بيو-تقارب عالية من أيونات الفضة للبروتين، وأساساً سلفهيدريل والكربوكسيل مجموعات من السلاسل الجانبية، وتميل إلى وصمة عار بروتينات حمضية أكثر كفاءة7. بعد أيون الفضة ملزمة، يتم تطبيق حل النامي (عادة مصنوعة من محلول كربونات المعادن يحتوي على ثيوسولفاتي فورمالدهايد والصوديوم) للحد من أيونات الفضة للحبوب الفضي المعدني، التي بناء لون الظلام-براون تصور نطاقات البروتين.
على الرغم من تلطيخ الفضة معروفة جيدا لبراعة وحساسية عالية منذ تطورها في السبعينات8، يعتبر الأسلوب كثيرا ما صعبة كما. أساليب تلوين الفضة خطوات مقيدة بالوقت وإظهار إمكانية تكرار نتائج منخفضة. منذ لون فضي وصمة عار لا عادة موحدة وتعتمد على فترة خطوة التخفيض، مما يصعب التحكم، وصمة عار الفضة ليس أسلوب كمي، وهكذا، لا ينصح لجل مقارنة بين الدراسة والبروتين الكمي9. قد تستخدم أساليب محسنة في حساسية الألدهيدات التي يمكن أن توفر أيضا موحد أكثر تلطيخ10. ومع ذلك، وهذا على حساب إجراء مزيد من التحليل المصب بسبب كروسلينكينج للبروتينات التي الألدهيدات. بروتوكولات سريعة معظمها الجمع أو تقصير خطوات للحد من الوقت، المساس بإمكانية تكرار نتائج والتوحيد من وصمة عار5. نتيجة لذلك هناك العديد الفضة تلطيخ المتغيرات داخل جل البروتين تلطيخ، كل الأمثل لتناسب متطلبات معينة؛ على سبيل المثال، البساطة، والحساسية، أو الببتيد معدل الاسترداد لتحليل المتلقين للمعلومات. هذه السمات قد تؤثر أيضا على بعضها البعض، وتلبية جميع الاحتياجات في بروتوكول واحد يمكن أن يكون صعباً.
في هذا العمل، نحن نقدم فضية فلورسنت جديدة تلوين الأسلوب للكشف عن البروتين في جل polyacrylamide. في هذا الأسلوب، نستخدم تحقيق فلوروجينيك لأيونات الفضة، TPE-4TA (الشكل 1)، أن تصور البروتينات مشربة فضة11. تم تصميم TPE–4TA بمبدأ الانبعاثات الناجمة عن تجميع (المترشح). هو غير عندما تذوب في المحلول، ولكن شدة حضور أيونات الفضة. بالاستعاضة عن تطوير اللونية في البقع الفضية التقليدية مع فلوروجينيك وضع الخطوة، يتيح الأسلوب الفضة الفلورسنت تلطيخ قوية من مجموع البروتينات مع خلفية انخفاض.
وعلاوة على ذلك، أظهرت وصمة الفضة الفلورسنت مجموعة خطي دينامية جيدة لتقدير البروتين، وقابلة للمقارنة مع وصمة “روبي سيبرو” يستخدم على نطاق واسع ولا يمكن تحقيقه مع البقع الفضية التقليدية. يمكن تصويرها على أنظمة التوثيق جل استخداماً مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية الهلام (الطول الموجي الإثارة: 302/365 نانومتر القناة؛ والانبعاثات: ~ 490-530 نانومتر) في مختبرات بيولوجية عديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدم هنا هو فضة فلورسنت رواية تلطيخ الأسلوب للبروتينات في المواد الهلامية polyacrylamide. ويدمج هذه الاستراتيجية البقع الفضية التقليدية والبقع الفلورسنت. التحقيق مآثر المصبوغة الربط الانتقائي لايون الفضة للبروتينات كما هو الحال في غيرها الفضة بقع لكنها توظف فضية فلوروجينيك حساسة للغاية TPE-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر باتريك تشان في مركز لاو وأي مينغ “الطب الترميمي”، ومعهد كارولينسكا، لدعمه التقني. عاشرا – س. ممتن للدعم من “مجلس البحوث السويدية” (منحة رقم 2017-06344).
Materials
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | – | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | – | Equipment |
Referências
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
