Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama
Summary
Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.
Abstract
Gümüş boyama polyacrylamide Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) takip jelleri bantlarında protein görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir Renkölçer tekniktir. Klasik gümüş lekeleri yüksek arka plan boyama, zavallı protein kurtarma, düşük tekrarlanabilirlik, miktar ve kütle spektrometresi (MS) ile sınırlı uyumluluk için dar bir doğrusal Dinamik Aralık gibi bazı dezavantajları var. Şimdi, bir fluorogenic Ag+ sonda, TPE-4TA, kullanımı ile floresan bir gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jellerin toplam protein görselleştirme için geliştirdik. Bu yeni leke geleneksel gümüş lekeleri zahmetli gümüş azaltma adımda önler. Ayrıca, floresan gümüş leke iyi tekrarlanabilirlik, ışık hassasiyeti ve protein bulunması, yapım o bir yararlı ve pratik protein jel leke doğrusal miktar gösterilmektedir.
Introduction
Birçok boyama yöntemi Jel Elektroforez takip, örneğin Coomassie parlak mavi, gümüş leke, Floresans gibi Renkölçer boya kullanarak proteinler görselleştirmek için kullanılan veya radyoaktif1,2, etiketleme olmuştur 3 , 4. gümüş boyama olarak kabul edilir en hassas teknikleri için basit ve ucuz reaktifler gerektiren protein algılama biri olmak. İki büyük aile sınıflandırılabilir:5,6ammoniacal gümüş leke ve gümüş nitrat leke. Alkali ammoniacal gümüş yönteminde, gümüş-diamin karmaşık amonyak ve sodyum hidroksit ile üretilen ve metalik gümüşe asidik formaldehit çözümünü kullanarak geliştirme sırasında düşük. Leke temel proteinler için verimli bir şekilde karşılar ama asidik ve tarafsız proteinler için güvenliği aşılan bir performansı gösterir ve ayrıca, klasik glisin ve taurin elektroforetik sistemleri için sınırlı olduğunu. Buna karşılık, gümüş nitrat lekeleri yüksek biyo-benzeşme protein gümüş iyonların yararlanmak, öncelikle sulfhydryl ve karboksil grupları yan zincirlerinden ve asidik protein daha verimli bir şekilde leke eğilimi7. Bağlama gümüş iyonu sonra (genellikle formaldehit ve sodyum tiyosülfat içeren metal karbonat çözeltisi imal) gelişmekte olan bir çözüm görselleştirmek için bir kahverengi koyu rengi inşa Metalik Gümüş tahıl için gümüş iyonları azaltmak için uygulanır protein bantları.
Gümüş boyama gelişimi 1970’li yıllarda8beri onun çok yönlü ve yüksek hassasiyet için bilinen olmasına rağmen yöntem sık kadar zor kabul edilir. Gümüş boyama yöntemleri zaman sınırlı adımlar ve düşük tekrarlanabilirlik göster. Gümüş leke rengi genellikle tek tip ve kontrol etmek zordur, azaltma adım bağımlı olmadığından gümüş leke nicel bir yöntem değildir ve böylece, jel karşılaştırma çalışma ve protein miktar9için tavsiye edilmez. Duyarlılık içinde en iyi duruma getirilmiş yöntemleri de10boyama daha fazla üniforma sağlayabilir aldehitler yararlanmak olabilir. Ancak, daha fazla akış aşağı analiz protein aldehitler tarafından polietilenin nedeniyle pahasına bu. Hızlı iletişim kuralları çoğunlukla birleştirmek ya da uzlaşma tekrarlanabilirlik ve leke5tekdüzelik süresini kısaltmak için adımları kısaltabilirsiniz. Sonuç olarak, orada çok sayıda gümüş türevleri içinde protein jel, her belirli gereksinimleri uyacak şekilde en iyi duruma getirilmiş boyama boyama; Örneğin, basitlik, duyarlılık veya peptid kurtarma oranı için aşağı akım analizi. Bu öznitelikler de birbirlerine bir etkiye sahip ve bir iletişim kuralı tüm gereksinimlerinin karşılanması zor olabilir.
Bu çalışmada, biz yeni bir floresan gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jel protein algılama için tanıtmak. Bu yöntemde, bir fluorogenic sonda gümüş iyonları, TPE-4TA (şekil 1), gümüş emdirilmiş proteinler11görselleştirmek için kullanıyoruz. TPE-4TA toplama kaynaklı emisyon (AIE) ilke tarafından tasarlanmıştır. Bu sigara-sulu çözüm içinde çözünmüş zaman yayıcı ama gümüş iyonlarının varlığında son derece yayıcı. Geleneksel gümüş lekeleri chromogenic geliştirilmesinde adım gelişen bir fluorogenic ile değiştirerek, floresan gümüş yöntemi azaltılmış bir arka plan ile toplam proteinlerin sağlam boyama sağlar.
Ayrıca, floresan gümüş leke için yaygın olarak kullanılan SYPRO Ruby leke ile karşılaştırılabilir ve geleneksel gümüş lekeleri ile ulaşılabilir protein miktar iyi dinamik bir doğrusal Aralık gösterdi. Jel bir ultraviyole lamba ile sık kullanılan jel dokümantasyon sistemleri üzerinde yansıma (uyarma dalga boyu: 302/365 nm kanal; emisyon: ~ 490-530 nm) birçok biyolojik laboratuarlarında.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan bir roman floresan gümüş yöntemi polyacrylamide jeller proteinler için boyama. Bu strateji geleneksel gümüş lekeleri ve floresan lekeleri bütünleştirir. Proteinlere olduğu gibi diğer gümüş gümüş iyonu seçmeli bağlama lekeleri ama son derece hassas fluorogenic gümüş kullanır boyama patlatır gümüş ilişkili proteinler kadar ışık için TPE-4TA sonda. Fluorogenic sonda TPE-4TA oldukça düşük konsantrasyon nanomolar Aralık11…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Patrick Chan Ming Wai Lau merkezinde onarıcı tıp, Karolinska Institutet, onun teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. S. X. İsveçli Araştırma Konseyi (Grant No 2017-06344) destek için minnettar olduğunu.
Materials
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | – | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | – | Equipment |
Referências
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
