Tot oprichting van de cellijnen Overexpressing DR3 om te beoordelen van de Apoptotic reactie op anti-mitotische Therapeutics
Summary
Tot vaststelling van een stabiel cellijn overexpressing een gen van belang zijn voor het bestuderen van de genfunctie kan gebeuren door stabiele transfectie-picking enkele klonen na transfecting hen via retrovirale infectie. Hier laten we zien dat HT29-DR3 cellijnen gegenereerd op deze manier verhelderen de mechanismen door welke dood receptor 3 (DR3) draagt bij tot antimitotics-veroorzaakte apoptosis.
Abstract
Bestuderen van de functie van een gen van belang kan worden bereikt door het manipuleren van het niveau van meningsuiting, zoals minderen qua uitdrukkingswijze met vechtpartij cellijnen of het verhogen van de expressie met overexpressie cellijnen. Voorbijgaande en stabiele transfectie zijn twee methoden die worden vaak gebruikt voor exogene genexpressie. Voorbijgaande Transfectie is alleen handig voor korte termijn expressie, overwegende dat stabiele transfectie kunt exogene genen worden geïntegreerd in het genoom van de cel host waar het voortdurend zal worden uitgedrukt. Dientengevolge, is stabiele transfectie meestal werkzaam voor onderzoek in lange termijn genetische verordening. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het genereren van een stabiele cellijn tagged dood receptor 3 (DR3) te verkennen DR3 functie overexpressing. We pakte enkele klonen na een retrovirale infectie teneinde de homogeniteit en de zuiverheid van de stabiele cellijnen. De stabiele cellijnen gegenereerd met behulp van dit protocol maken DR3-deficiënte HT29 cellen gevoelig voor antimitotische geneesmiddelen, aldus bijenpopulatie de apoptotic reactie in HT29 cellen. Bovendien, de vlag-tag op DR3 compenseert de onbeschikbaarheid van goede DR3 antilichaam en vergemakkelijkt de biochemische studie van het moleculaire mechanisme waarmee antimitotische agenten apoptosis induceren.
Introduction
Heterologe genexpressie is vaak aangewend om te bestuderen van de functie van genen van belang. Twee methoden, voorbijgaande en stabiele transfectie, worden prevalently gebruikt in cellen en moleculaire biologie aan een segment van DNA of RNA invoegen een host cel1,2. Transient-transfected DNA of RNA kan niet worden doorgegeven aan dochtercellen, zodat de genetische wijziging kan alleen worden gehandhaafd voor een korte periode van tijd. Aan de andere kant, in stabiel transfected cellen, zijn exogene genen geïntegreerd in het ontvangende cel genoom, behoud van de expressie in de cellijn. Dus, stabiele transfectie is een methode die is meestal gereserveerd voor onderzoek naar lange termijn genetische verordening. De stabiele cellijn kan ook worden getransplanteerd zoals xenografts in Muismodellen voor in vivo studie3. Stabiele transfectie kan worden onderverdeeld in twee categorieën: virale en nonviral. In vergelijking met nonviral transfectie, kunt virale infectie overbrengen van genen in een breder scala aan menselijke cellen met een hogere efficiëntie4,5,6,7. Bovendien biedt een stabiele cellijn van een enkele kloon het voordeel van homogeniteit en klonen zuiverheid.
Ongecontroleerde celgroei en deling zijn de meest onderscheidende kenmerken van de kanker. In klinische instellingen zijn antimitotische agenten de primaire behandelingen voor vele soorten tumoren8. Echter, enkele belangrijke beperkingen van antimitotische agenten kunnen niet worden genegeerd. Eerst, deze chemokuren kunnen ook doden normale cellen samen met de ongewenste kankercellen en, dus, kunnen leiden tot ernstige bijwerkingen8. Tweede, antitubulin medicijnen zijn niet effectief tegen alle soorten tumoren, ondanks tubuline de alomtegenwoordige expressie in een breed scala aan verschillende weefsels als een cytoskeletal eiwit9,10. Het is onduidelijk waarom antitubulin agenten toonde veelbelovende werkzaamheid tegen ovariële, Long-, en hematologische kankers in klinische behandeling, maar niet in de nier, dubbele punt of alvleesklier kanker11. Ten slotte, zelfs patiënten met hetzelfde type tumor kunnen reageren op de antimitotics anders op een onvoorspelbare wijze. Kan er een belangrijke effector molecuul dat is van invloed op de gevoeligheid van verschillende patiënten aan antimitotische agentia, resulterend in de uiteenlopende resultaten gezien in klinische behandeling12. Dus moeten de potentiële differentiële gevoeligheden van patiënten antimitotische behandeling in aanmerking worden genomen voor het optimaliseren van therapeutische interventies13.
Een high-throughput geheel-genoom siRNA bibliotheek scherm aangetoond dat DR3 knockdown gevoelige cellen resistent tegen antimitotische geneesmiddelen, we een rol voor DR3 in chemotherapie-veroorzaakte apoptosis14kan renderen. Als een lid van de tumor necrose factor receptor (TNFR) superfamilie, is DR3 gemeld te bemiddelen cel apoptosis in verschillende systemen15,16,17,18. Dus zetten we uit om stabiele cellijnen DR3 om te bestuderen van de moleculaire mechanismen waarmee antimitotische geneesmiddelen apoptosis induceren overexpressing. Een model van de juiste cel voor het bestuderen van DR3 overexpressie kan worden verstrekt door de menselijke Colón kanker cellijn HT29, die bleek te zijn DR3-deficiënte. Bovendien, in de kliniek, dikke darm kankers zijn ongevoelig voor antimitotische geneesmiddelen19.
In dit artikel beschrijven we een methode waarmee de generatie van een HT29-DR3 stabiele cellijn door retrovirale infectie. Verder laten we zien hoe de DR3 expressie in deze cellen gebruikend het westelijke bevlekken valideren en hoe om te beoordelen van de gevoeligheid voor antimitotische agentia met behulp van een cel levensvatbaarheid assay en morfologische observatie. De cellen van één klonen worden versterkt en, dus, hebben het voordeel van een homogene genetische achtergrond. Bovendien mag de vlag-tag op DR3 voor de visualisatie van cellulaire DR3 door microscopie en analyse van gen expressie en eiwit interactie door biochemische benaderingen. Bovendien, kunnen de cellen xenografted in muizen aan tumor progressie in reactie op antimitotics in vivo14verder te analyseren.
De HT29-DR3 cel systeem gepresenteerd hier aangeboden een doeltreffend instrument voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van hoe antimitotics doden van kanker cellen14. Aangezien overexpressie en vechtpartij cellijnen gemeenschappelijke hulpmiddelen zijn voor de bestudering van de genfunctie, kan dit protocol worden aangepast gemakkelijk aan andere genen van belang of andere cellijnen en, dus, omgevormd tot een veel gebruikte aanpak.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een methode voor het genereren van HT29-DR3 stabiele cellijnen. HT29-DR3 cellen bieden een model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die door die DR3 draagt bij aan apoptosis geïnduceerd door antimitotische agenten. Deze aanpak is veelzijdig en herhaalbaar. Om te verzekeren het succes van de procedure, vier belangrijke stappen van het protocol moeten worden overwogen. Eerst, produceren een hoog genoeg virus titer, wordt u aangeraden uitvoeren DNA transfectie wanneer de Pla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies 53110000117 (naar G.W.) en 043222019 (met X.W.) van Tsinghua Universiteit.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
Referências
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
