Gründung von Zelllinien überexprimiert DR3 um die Apoptotic Antwort auf Anti-mitotische Therapeutika zu bewerten
Summary
Aufbau einer stabilen Zelllinie überexprimierenden gen des Interesses Genfunktion zu studieren kann durch stabile Transfektion-Kommissionierung einzelnen Klone nach transfecting sie über retroviralen Infektion durchgeführt werden. Hier zeigen wir, dass HT29-DR3 Zelllinien erzeugt auf diese Weise die Mechanismen aufzuklären, welche, die Tod Rezeptor 3 (DR3) zum Mitosehemmstoffen-induzierten Apoptose beiträgt.
Abstract
Die Funktion eines Gens von Interesse kann erreicht werden, durch die Manipulation der Ebene des Ausdrucks, wie seinen Ausdruck mit Knockdown Zelllinien verringern oder erhöhen ihren Ausdruck mit Überexpression Zelllinien. Transiente und stabile Transfektion sind zwei Methoden, die häufig für exogene Genexpression verwendet werden. Transiente Transfektion eignet sich nur für kurzfristige Ausdruck, während beständigen Transfection erlaubt exogenen Gene in das Wirtsgenom Zelle integriert werden, wo wird es kontinuierlich zum Ausdruck gebracht werden. Infolgedessen wird beständigen Transfection normalerweise für die Forschung in langfristige genetische Regulation eingesetzt. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll um eine stabile Zelllinie überexprimierenden tagged Tod Rezeptor 3 (DR3) DR3 Funktion erkunden zu generieren. Wir entschieden uns für einzelne Klone nach einer retroviralen Infektion um die Homogenität und Reinheit der stabilen Zelllinien erhalten. Die stabilen Zelllinien erzeugt unter Verwendung dieses Protokolls Rendern DR3-defizienten HT29-Zellen empfindlich gegenüber antimitotic Medikamente, somit Neuaufbau der Apoptotic Antwort in HT29-Zellen. Darüber hinaus das FLAG Tag auf DR3 kompensiert die Nichtverfügbarkeit von guten DR3 Antikörper und erleichtert die biochemische Untersuchung des molekularen Mechanismus mit dem antimitotic Agents Apoptose induzieren.
Introduction
Heterologe Genexpression wird oft eingesetzt, um die Funktion von Genen von Interesse zu untersuchen. Zwei Methoden, transiente und stabile Transfektion werden hauptsächlich in den Zellen und Molekularbiologie verwendet, um ein Segment von DNA oder RNA in einem Host Zelle1,2einfügen. Transient transfizierten DNA oder RNA werden nicht an Tochterzellen, weitergegeben also die genetische Veränderung nur für einen kurzen Zeitraum beibehalten werden kann. Auf der anderen Seite sind stabil transfizierten Zellen exogenen Gene in das Wirtsgenom Zelle, Erhaltung der seinen Ausdruck in der Zell-Linie integriert. So ist beständigen Transfection eine Methode, die normalerweise reserviert ist für die Erforschung langfristiger Genregulation. Die stabile Zelllinie kann auch transplantiert werden, wie Xenotransplantate in Mausmodellen für in Vivo 3studieren. Beständigen Transfection kann in zwei Kategorien unterteilt werden: virale und nonviral. Im Vergleich zu nonviral Transfektion, kann virale Infektion Gene in einer größeren Vielfalt von menschlichen Zellen mit einer höheren Effizienz4,5,6,7übertragen. Darüber hinaus bietet eine stabile Zelllinie aus einem einzigen Klon den Vorteil klonalen Reinheit und Homogenität.
Unkontrolliertem Zellwachstum und Division sind die am meisten charakteristischen Merkmale von Krebs. Im klinischen sind antimitotic Agents die primären Behandlungen für viele Arten von Tumoren8. Jedoch können nicht einige erheblichen Einschränkungen der antimitotic Agents ignoriert werden. Zuerst diese Chemotherapien können auch normale Zellen zusammen mit den unerwünschten Krebszellen töten und somit schwere Nebenwirkungen8führen können. Zweite, antitubulin Medikamente sind nicht wirksam gegen alle Arten von Tumoren, trotz Tubulin der allgegenwärtige Ausdruck in einer Vielzahl verschiedener Gewebe als ein Zellskelett Protein9,10. Es ist unklar, warum antitubulin Agenten vielversprechende Wirksamkeit gegen zeigte Eierstock-, Lungen- und hämatologischen Krebserkrankungen in der klinischen Behandlung, aber nicht in Niere, Darm oder Pankreaskarzinome11. Schließlich können auch Patienten mit der gleichen Art des Tumors auf die Mitosehemmstoffen anders auf unvorhersehbare Weise reagieren. Gibt es möglicherweise ein wichtiger Effektor-Molekül, das die Empfindlichkeit der verschiedenen Patienten antimitotic Agents, wodurch die unterschiedlichen Ergebnisse in klinischen Behandlung12gesehen betrifft. Daher sollte die potenzielle differentielle Befindlichkeiten der Patienten antimitotic Behandlung berücksichtigt werden um therapeutische Interventionen13zu optimieren.
Ein Hochdurchsatz-Vollständiggenom SiRNA-Bibliothek-Bildschirm gezeigt, dass DR3 Zuschlag lichtempfindlichen Zellen resistent gegen antimitotic Drogen eine Rolle für DR3 Chemotherapie-induzierte Apoptose14verwickelt sein könnte. Als Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor (TNFR)-Superfamilie berichtet DR3 Zellapoptose in verschiedenen Systemen15,16,17,18zu vermitteln. So brachen wir zu stabilen Zelllinien überexprimiert DR3 um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, mit denen antimitotic Drogen Apoptose induzieren. Eine entsprechende Zellenmodell für das Studium DR3 Überexpression menschlichen Dickdarm-Krebs-Zelllinie HT29, arrangiert für die DR3-defizienten sein gefunden wurde. Darüber hinaus in der Klinik Doppelpunkt Krebsarten sind unempfindlich gegen Antimitotic Drogen19.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode, die die Generation eine stabile Zelllinie HT29-DR3 durch retroviral Infektion ermöglicht. Weiter zeigen wir wie man DR3 Ausdruck in diesen Zellen verwenden westliche Beflecken zu validieren und wie die Empfindlichkeit gegenüber antimitotic Agents beurteilt mithilfe einer Zelle Lebensfähigkeit Assay und morphologische Beobachtung. Die Zellen werden aus einzelnen Klone verstärkt und somit haben den Vorteil von einem homogenen genetischen Hintergrund. Darüber hinaus erlaubt die FLAG-Tag auf DR3 zur Visualisierung von zellulären DR3 durch Mikroskopie und Analyse von gen-Ausdruck und Protein-Interaktion durch biochemische Ansätze. Darüber hinaus kann die Zellen xenografted bei Mäusen, Tumorprogression als Reaktion auf Mitosehemmstoffen in Vivo14weiter zu analysieren.
Die hier vorgestellten HT29-DR3-Zellsystem angeboten ein wirksames Instrument für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der wie Mitosehemmstoffen Krebs Zellen14töten. Da Überexpression und Knockdown Zelllinien gemeinsamen Werkzeuge für das Studium der Genfunktion sind, kann dieses Protokoll leicht mit anderen Genen von Zinsen oder anderen Zelllinien angepasst und so verwandelte sich in einen extensiv genutzte Ansatz.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode um HT29-DR3 stabilen Zelllinien zu generieren. HT29-DR3 Zellen stellen ein Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die DR3, Apoptose induziert durch antimitotic Agents beiträgt. Dieser Ansatz ist vielseitig und wiederholbar. Um den Erfolg des Verfahrens zu gewährleisten, müssen vier Schritte des Protokolls berücksichtigt werden. Zuerst, um einen hohen produzieren genug Virustiter empfiehlt es sich, DNA-Transfektion durchführen, wenn die Plat-A-Zelle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des 53110000117 (zu g.w.) und 043222019 (zu X.W.) an der Tsinghua University unterstützt.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
Referências
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
